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斑点酶标株联法与粪孵法检测动物寄生虫病探讨 　　摘要　利用斑点酶标株联法、粪孵法及粪渣镜检法，对检出牛是否患血吸虫、肝片吸虫、锥虫病等寄生虫病各有所长，其中以斑点酶标株联法加粪孵法为检测动物寄生虫病的最佳组合。 　　关键词　检测；斑点酶标株联法；粪孵法；寄生虫；动物；牛 　　中图分类号　S855 　　文献标识码　A 　　文章编号　1004-8421(2009)06-102-01 　　 　　安徽省桐城市是动物血吸虫病流行区之一，也是动物肝片吸虫病、锥虫病流行区。这些寄生虫病严重威胁着牛体健康，阻碍着畜牧业生产的发展，直接影响公共卫生和人体健康。因此，做好这3种寄生虫病的查治工作尤为重要。笔者从事动物血吸虫病查治工作多年，采用的方法也较多，如：粪孵法，日本血吸虫病间接血凝血纸诊断法、血清诊断法，动物血吸虫、肝片吸虫、锥虫病斑点酶标株联诊断法等，在实践应用上，笔者认为斑点酶标株联法加粪孵法在检测动物寄生虫病中是最佳组合。 　　 　　1　点酶标株联法简介 　　 　　将血吸虫、肝片吸虫、锥虫抗原吸附在硝酸纤维素膜上，制成快诊膜。在同一张快诊膜上能同时检测出血吸虫、肝片吸虫、锥虫病抗体，是一项实用性新技术。 　　 　　2　器械及材料 　　 　　2.1　主要器械　20μl和100μl可调微量移液器各1支及滴头若干个，50μl或100ml烧杯4只，5ml或10ml试管若干支，5或10ml吸量管3支，100ml量筒2只，直径0.55cm活页纸打孔机1个，眼科镊子1把；粪杯、40～60孔／寸粪筛、500ml长颈烧瓶、筷子、药棉若干，普通显微镜1台，载玻片若干。 　　 　　2.2　主要材料 　　2.2.1　试验用化学试剂。生理盐水500mld3瓶、吐温20和过氧化氢各1瓶。 　　2.2.2　斑点酶标株联快诊盒。由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所提供。快诊盒内备有专用试剂和快诊膜，每盒可检测300份血样。 　　2.2.3　反应试剂。专用试剂1～5由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所、浙江省农业厅动物血防站提供；试剂6～10临用时按照浙江省农业科学院畜牧兽医研究所、农业厅动物血防站制定的斑点酶标株联诊断法操作规程之规定配制。 　　2.2.4　待检血纸样。采自桐城市嬉子湖镇双店、松???两个村216头水牛。将滤纸剪成1.5cm，宽8～10cm长的条状，编号。针刺水牛耳静脉，鲜血滴于滤纸上凉干待检。 　　2.2.5　待检粪便。采集同一来源当日水牛新鲜粪便100～200g，填写粪卡，编号分装待检。 　　 　　3　试剂6～10 　　 　　3.1　试剂6　1包试剂1配500ml生理盐水，溶解后加入2ml吐温20混匀即成。 　　3.2　试剂7　1包试剂2配500ml生理盐水溶解混匀即成。 　　3.3　试剂8　量取25ml试剂6倒入烧杯中，将试剂3纸片浸入即成。 　　3.4　试剂9　吸取5ml试剂6加入试剂4中，待溶解后倒入烧杯中，再加20ml试剂6混匀即成。 　　3.5　试剂10　量取40ml试剂7倒入烧杯中，置37℃恒温箱避光溶解后，取出置室温避光处待用。 　　 　　4　检测方法 　　 　　4.1　斑点酶标株联诊断法　按照浙江省农业科学院畜牧兽医研究所、农业厅动物血防站研制的斑点酶标株联诊断法操作规程进行操作。 　　4.1.1　编号。用铅笔在试管和快诊膜(右端)写上待检血纸号，将快诊膜放人相应号的试管中，每试管再加试剂61.5ml。 　　4.1.2　加待检血样孵育。用打孔机将待检血纸打下圆片一张放人相应号的试管中，置37℃孵育60min，每隔20min轻摇试管1次。 　　4.1.3　洗涤加试剂8反应。用镊子将每支试管中快诊膜夹出，放入盛有45ml试剂6烧杯中，轻摇洗涤3次，每次间隔3min；再将快诊膜夹出放到滤纸上吸干水份，放人盛有试剂8烧杯中，用镊子翻动使膜充分接触液体，再置37℃反应60min，每隔20min翻动膜1次。 　　4.1.4　洗涤加试剂9反应。快诊膜用试剂6洗涤3次(方法同4.1.3节)，用滤纸吸干水份后放入盛有试剂9烧杯中，用镊子翻动使膜充分接触液体，置37℃反应40min，每隔20min翻动膜1次。 　　4.1.5　洗涤加试剂10显色反应。快诊膜用试剂6洗涤3次(方法同4.1.3节)，用滤纸吸干水分放入盛有试剂10与30％过氧化氢40μl混合液的烧杯中，轻摇烧杯3～20min。 　　4.1.6　中止反应。待有任一斑点出现后，弃去反应液，用自来水充分洗涤至水清为止。 　　4.1.7　结果判定。目测视呈棕色、黄色为阳性，无色为阴性；以膜编号端为右端，左圆斑为血吸虫病、中间圆斑为锥虫病、右圆斑为肝片吸虫病。 　　 　　4.2　粪孵法　每头份取粪样100g左右放于粪杯中