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DNA标记技术在乳酸菌 分类鉴定中的应用 主要内容 概述 基于PCR的DNA标记技术 基于16S或23S rDNA测序的DNA标记技术 限制性片段长度多态性标记技术 扩增片段长度多态性标记技术 电泳核型标记技术 DNA杂交和DNA探针技术 变性梯度凝胶电泳标记 一、概述 乳酸菌由于具有许多有益的代谢特征和人类长期安全使用,被广泛认为是GRAS(Generally recognized as safe） 级的微生物，在食品及医药中广泛应用。 　　分类鉴定是微生物学中的一个重要领域，乳酸菌在食品发酵工业中作为食品和药品资源的长期应用， 人们已经能够根据乳酸菌的代谢特征、生长性状、工业生产能力、在末端产物中的存活能力以及作用靶位等特征对LAB进行鉴别和分类 。但是传统上对微生物的鉴定分类是利用形态学和生理学特征及其差异来进行的，存在诸多局限性。 随着分子生物学的快速发展，从分子和基因水平来研究乳酸菌的分类学已成为研究热点。 近年来，随着DNA标记技术的不断成熟,人们建立了一系列的以DNA标记为基础的微生物鉴定和检测技术。 根据菌株之间的遗传距离所产生的DNA指纹的差异来直接反映检测微生物菌株的DNA多态性来对其鉴定和分型。 这些技术的最大优势就是可以被免各种复杂的微生物生长条件，不需要预先培养就可以鉴定和检测。多数研究结果表明DNA标记分型技术具有从种属到菌株各种水平的鉴别能力，为乳酸菌的快速分子鉴定和分型提供了借鉴。 二、基于PCR的DNA标记技术 　　1、特异性扩增靶DNA片段 　　通过设计特异性的引物在一定的条件下通过聚合酶链式反应PCR选择性的特异扩增特定的靶DNA片段。 理论上讲可以在任何分类水平上对微生物菌株进行区别和鉴 定。 　　２、随机扩增多态性DNA标记 　　随机扩增多态性ＤＮＡ的基本原理是利用随机引物通过ＰＣＲ反应非定点扩增ＤＮＡ片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物ＤＮＡ片段的多态性，扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的ＤＮＡ多态性。 三、基于16S或23S rDNA测序的DNA标记技术 当对被鉴定的细菌分离株毫无所知的情况下。Vandamm认为最为有效的方法就是对13S 或23S rDNA 进行测序 。然后将获得的序列同数据库中现有的序列进行比照。常用的数据库有EMBL和Genebank。可以通过BLAST或者FASTA等搜索程序在数据库中查找到乳酸菌相应的DNA序列 。Booysen 2002年将来自麦汁加工过程中的乳酸菌分离株通过对16S rDNA进行测序， 可以在亚种水平上进行区分和鉴定。 四、限制性片段长度多态性标记技术 1980年botstein等首先提出利用限制性片段长度多态性（RFLP）作为标记构建遗传图谱。RFLP基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段DNA即获得反映个体特异性的RFLP图谱。 五、扩增片段长度多态性标记技术 扩增片段长度多态性（AFLP）是1933年由荷兰科学家Zabeau和 VOS发展起来并获得专利的一种检测DNA多态性的新方法。该方法结合了RFLP和RAPD技术的特点,被认为是迄今为止最有效的分子标记技术。不论所研究的基因组DNA是何来源有多复杂。从理论上讲，用AFLP方法都可以检出它们之间的多态性。 AFLP的基本原理就是利用PCR技术选择性扩增基因组DNA双酶切的限制性片段, 基因组DNA经限制性内切酶消化后,将一双链DNA接头连接于限制性片段的两端.然后根据接头序列和限制位点邻近区域的碱基序列,设计一系列3’ 末端含数个随机变化的选择性碱基的PCR引物。进行特异性扩增。只有那些限制位点的侧翼序列与引物3’末端选择碱基相匹配的限制片段才能得以扩增。 六、电泳核型标记技术 　　电泳核型 （EK）标记技术是利用脉冲场电泳(PFGE)将用稀有位点酶, 对菌株完整的基因组DNA进行消化后的大片段ＤＮＡ进行分离。其技术关键是要求提取到完整的染色体ＤＮＡ， 因此它比其他的指纹鉴定策略更耗时间和工作量。然而，电泳核型分析的大片段ＤＮＡ能够反映到整个基因组的情况。 因此具有良好的区分能力，可以有效的把大量的微生物中区别到亚种水平。 七、 ＤＮＡ杂交和ＤＮＡ探针技术 这种方法在种的鉴定上具有一定的优势，但是耗时耗力。影响该项技术的推广应用。DNA探针技术在菌种鉴定和医学诊断上具有广泛的用途。乳酸菌的核糖体分型技术是利用限制性内切酶消化DNA 后再用 rDNA 探针来检测产生的DNA片段。Lyhs等2002年应用核糖体分型技术成功鉴定了真空包