替米沙坦对血管紧张素Ⅱ所致血管内皮细胞游离钙离子抑制作用.docVIP

替米沙坦对血管紧张素Ⅱ所致血管内皮细胞游离钙离子抑制作用 　　[摘要] 目的 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对细胞钙库的应激效应及替米沙坦对此的拮抗作用。 方法 预防性实验分组：正常对照组、AngⅡ 0.1 μmol/L组和替米沙坦60、300、1000 μg/L预处理组；治疗性实验分组：正常对照组、AngⅡ 0.1 μmol/L组和AngⅡ+替米沙坦60、300、1000 μg/L组。分别检测各组试验前胞内钙离子浓度，记为0 h。体外培养的人大动脉血管内皮细胞预防性给予替米沙坦60、300、1000 μg/L培育30 min后，加入AngⅡ 0.1 μmol/L；或AngⅡ 0.1 μmol/L培育30 min后，再加入替米沙坦60、300、1000 μg/L，分别于共同作用0.5、2、8和24 h采用激光共聚焦扫描显微镜成像法检测胞浆游离钙离子浓度。 结果 预防性实验：与正常对照组相比，替米沙坦60、300、1000 μg/L作用细胞30 min对胞浆游离钙离子浓度无明显影响，加入AngⅡ 0.1 μmol/L后，胞浆游离钙离子浓度立即（0 h）显著升高，均显著高于正常对照组（P 0.05），但显著低于AngⅡ组，并且替米沙坦预处理浓度越高抑制作用越强（P 0.05），作用时间对此无影响。治疗性实验：AngⅡ 0.1 μmol/L先诱导30 min后，再加入替米沙坦60 μg/L对升高的胞浆游离钙离子浓度无抑制作用；替米沙坦300 μg/L作用2 h或替米沙坦1000 μg/L作用0.5 h才显示其抑制作用（P 0.05），但均显著高于同一时间点的正常对照组。替米沙坦的作用时间对此无影响。 结论 AngⅡ能诱导内质网钙库向胞浆释放游离钙离子，而替米沙坦能有效拮抗AngⅡ对内质网的应激作用及促使胞浆游离钙离子重新被内质网重吸收。预防性给予替米沙坦的拮抗作用较治疗性给予的拮抗作用显著。 　　[关键词] 替米沙坦；血管内皮细胞；血管紧张素Ⅱ；钙离子 　　[中图分类号] R972.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（c）-0011-05 　　高血压、动脉硬化、冠心病等心血管系统疾病的发生发展过程中均存在着以内皮细胞所分泌的一氧化氮（NO）减少而致血管舒张反应下降为主要特征的血管内皮系统功能障碍[1]。导致血管内皮细胞损伤的因素中，肾素-血管紧张素系统（RAAS），尤其是局部RAAS所产生的血管紧张素Ⅱ（angiotensin ，AngⅡ）在病理生理方面起着重要的作用[2]。异常升高的AngⅡ可通过与血管内皮细胞内的AT1受体结合，引起细胞钙超载并启动一系列的细胞凋亡信息转导过程。替米沙坦（Telmisartan）是新型的长效AngⅡ受体拮抗剂，其作用机制主要是与AT1受体结合，阻断AngⅡ对AT1受体的激动作用，作为临床一线降压药被广泛应用。以往的研究显示，替米沙坦对由高糖或AngⅡ等因素所致的血管内皮细胞损伤具有保护作用[3-6]。静息生理状态下，细胞内钙离子主要储存在内质网内，使细胞内游离钙离子保持在极低的水平约1×10-7mol/L，细胞内外的钙离子浓度差大约为一万倍[7]。当遇到相应的刺激时，细胞会通过多种途径瞬间提高胞内局部或全部的钙离子浓度。其中主要的途径包括胞外钙离子的内流和胞内内质网应激释放储存在其的钙离子。细胞内钙离子浓度在细胞死亡过程中有变化，并且这种变化与许多病理状态相关。已有的研究报道中，在探讨替米沙坦对内皮细胞胞内游离钙离子浓度影响时，较少区分引起胞内钙离子浓度变化的途径或给予限制，本文通过采用无钙离子细胞培养基，消除细胞应激后钙离子从胞外内流的途径，探讨AngⅡ刺激后胞内钙离子的变化，观察替米沙坦对内质网源游离钙离子浓度的调控作用，以细化这两类物质（药物）对胞内钙离子影响及其诱发细胞凋亡的基础研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人大动脉血管内皮细胞株（VEC），PriCell公司；替米沙坦，森瑞化工有限公司；Ang Ⅱ，Sigma公司；胎牛血清，美国Hyclone公司；高糖DMEM培养基，美国Hyclone公司；无钙DMEM培养基，美国Hyclone公司；Fluo-3/AM，Sigma公司。替米沙坦和AngⅡ均用无钙无血清DMEM培养液溶解配成10 mg/L和2 μmol/L母液，用时以无钙无血清DMEM细胞培养液调节终末浓度。 　　1.2 细胞培养 　　常规复苏血管内皮细胞株，以含血清DMEM培养基（90%高糖DMEM培养基，10%胎牛血清）制备浓度为1×105/mL的血管内皮细胞悬浮液。取10 mL血管内皮细胞悬浮液置于75 cm2无菌培养瓶内，在5%CO2、37℃、湿度95%的条件中孵化培养，隔天置换培养液。当内皮细胞长至