桃树根际拮抗细菌CE抑菌物质对桃褐腐病菌抑制作用和稳定性研究.docVIP

桃树根际拮抗细菌CE抑菌物质对桃褐腐病菌抑制作用和稳定性研究 　　摘要：为了进一步了解拮抗细菌CE的抑菌作用机理。采用了膜透性试验、抑菌试验、电镜观察、孢子萌发和离体接种等方法进行了研究。结果显示，拮抗细菌CE抑菌物质能引起桃褐腐病菌菌丝细胞膜透性变化，导致电解质外渗和培养液电导率增加；致使菌丝和分生孢子形态异常，细胞内液泡增多，分生孢子不能萌发：并对桃褐腐病菌的侵染和病情的发展有明显的抑制和延缓的效果。同时通过温度、紫外线、酸碱度和蛋白酶等物理化学方法对抑菌物质进行了稳定性试验，结果表明，拮抗细菌CE的抑菌物质具有抑菌活性强、稳定性好的特点，具有较好的开发前景。 　　关键词：拮抗细菌；抑菌物质；抑菌机理；稳定性 　　中图分类号：S662.1　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)02-204-05 　　 　　褐腐病是果树的主要病害之一，如桃褐腐病、苹果褐腐病等，主要侵染果实，引起果实的腐烂，也可以侵染叶、幼芽和花等，而且在果实储藏和运输过程中也可以传染发病。其对北京郊区桃、苹果、李、杏等的生产造成很大的威胁。每年都给桃的生产造成很大的经济损失，大发生年份病果率可以达到50％以上，管理不好的果园病果率甚至可以达到90％以上。目前对该病的防治主要以化学防治为主，防治效果不甚理想，而且其对环境和人类身体健康有一定的威胁。因此，研究开发天然、安全、无毒、性能稳定的生防制剂，进行植物病害的防治，受到人们的普遍关注。自从1945年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生拮抗物质以来，人们已从枯草芽孢杆菌的不同菌株中分离出几十种抗菌物质，这些抗菌物质的性质包括简单的分子如低分子量的抗菌素和复杂的化合物如一些蛋白质类的抗菌物质，目前研究较多的拮抗物质有细菌素、抑菌蛋白、抗生素以及细菌次生代谢产物等。拮抗细菌CE是从北京平谷区桃树根围土壤中分离筛选得到的一株拮抗细菌，对桃褐腐病菌菌丝的生长有很强的抑制作用，我们针对CE菌株的抑菌物质对桃褐腐病菌细胞膜透性的破坏作用，对菌丝生长、分生孢子萌发和细胞形态结构的影响，以及对桃褐腐病菌侵染与扩展的影响进行了较为系统的研究，旨在为拮抗细菌CE的抑菌物质的开发与利用提供理论和实践依据，同时也为果树的安全生产提供新的生防材料。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1供试菌株 　　拮抗细菌CE：由北京市平谷区桃园土壤中分离筛选得到。 　　供试植物病原真菌：桃褐腐病菌由北京农学院植物保护教研室植物病理实验室提供。 　　1.2方法 　　1.2.1拮抗细菌CE抑菌物质的粗提取拮抗细菌CE于NA培养液中培养48h后，6000r?mln-1离心20min去除菌体，上清液用60％饱和度的硫酸铵4℃条件下直接盐析24h，8000r?mm-1离心30min，弃上清液，沉淀用0.02mol?L-1磷酸缓冲液(pH7.0)溶解，并透析48h，其间每12h换1次液，得到拮抗细菌CE抑菌物质的粗提取物，-20℃保存备用。 　　1.2.2拮抗细菌CE抑菌物质对桃褐腐病菌的抑菌作用(1)对桃褐腐病菌细胞膜透性的影响。将桃褐腐病菌接于盛有100mL PD培养液的三角瓶中，120r?min-1，27℃振荡培养14d，4000r?min-1离心5min，收集菌丝体。称取湿菌丝体5份，每份3g，加入20mL无菌水中，再分别加入拮抗细菌CE抑菌物质5、25、50、100μL，以不加抑菌物质的菌丝悬液为CK，立即取出5mL液体，用电导率仪分别测定各处理液体的电导率，每一浓度处理重复测定3次。将各处理余下的菌丝悬液在120r?min-1，27℃振荡培养1、2、3h后，4000r?min-1离心5min，取各处理上清液测定电导率。以电导率的变化表示抑菌物质对桃褐腐病菌细胞膜透性的影响。 　　(2)对桃褐腐病菌菌丝生长和菌丝形态结构的影响。将桃褐腐病菌孢子悬液涂于PDA平板上，然后用打孔器在平板中央打一个直径为8mm的孔，将100μL拮抗细菌CE抑菌物质注入孔内；27℃恒温培养，以PDA平板培养的正常孢子悬液为CK，待CK长到满皿后，测量抑菌圈直径。并用解剖刀在抑菌圈边缘切取直径为8mm的菌块。用戊二醛固定，经常规电镜制片方法处理后，分别用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察菌丝形态结构的变化。 　　(3)对桃褐腐病菌分生孢子萌发和分生孢子形态结构的影响。将分生孢子用无菌水配制成10mL孢子悬浮液(106-107个?mL-1)，加入10μL拮抗细菌CE的抑菌物质，观察孢子萌发情况。从PDA平板上切取长有大量桃褐腐病菌分生孢子的菌片，用1％的拮抗细菌CE抑菌物质浸泡4h，CK用无菌水浸泡，然后用戊二醛同定，采用常规电镜制片方法处理后，分别进行透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察，并拍照。 　　(4)对桃褐腐