滤膜法微量核酸快速提取技术规范 征求意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 滤膜法微量核酸快速提取技术规范 Protocol of mini nucleic acids extraction device based on affinity membrane filtration 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：2011.10.30） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 国家质量监督检验检疫总局发布 目次 前言 II 1　范围 3 2　规范性引用文件 3 3　方法原理 3 4　试剂和材料 3 5　操作步骤 4 附录A（规范性附录） 1 附录B（规范性附录）　 2 前言 本标准依据GB/T1.1-2009要求起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出。 本标准由全国进出口食品检测标准化技术委员会（SAC/TC445）归口。 本标准起草单位：天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：祁军、王馨、刘振宇、左锋、柴宏森、张霞、詹曦菁、魏永新、李智慧、尤其敏、胡林、崔景柏。 滤膜法微量核酸快速提取技术规范 范围 本标准规定了滤膜法微量核酸快速提取技术的操作内容。 本标准适用于口岸现场对病原体核酸的提取。 规范性引用文件 下列术语和定义适用于本文件 微量核酸提取装置 由核酸提取装置和抽吸装置组成。其中核酸提取装置内含有特异性吸附核酸的滤膜；抽吸装置为一次性10ml注射器。见附录A.1 样品前处理装置 为样本进行核酸提取前进行杂质过滤的装置，分为进样口、混匀区和出样口。在出样口处含有过滤膜，可去除样本中的杂质。见附录A.2 方法原理 滤膜法微量核酸快速提取技术提供了一种从各种微量临床样本中快速提取核酸的方法。微量核酸提取装置是利用滤膜可以特异性吸附核酸的特点，在临床样品进行裂解后，利用装置对临床样品进行过滤、吸附、清洗及洗脱，一次性提取核酸。 试剂和材料 裂解液 见附录B.1 清洗液Ⅰ见附录B.2 清洗液Ⅱ见附录B.2 洗脱液 见附录B.3 4%NaOH（处理痰液及脓性样本时使用） 生理盐水（处理分泌物棉拭子时使用） 微量移液器：体积范围为20μL-200μL；500μL-1000μL 10mL一次性注射器 微量核酸提取装置 样本前处理装置（过滤器） 1.5mL离心管（处理分泌物棉拭子时使用） 痰瓶（处理痰液及脓性样本时使用） 5mL离心管 0.6mL离心管 操作步骤 裂解 用微量移液器吸取1ml裂解液至样本前处理装置内，然后再吸取1mL全血、血清、尿液、胸水、腹水、脑脊液和液化后痰液等样本至本前处理装置内，盖上盖子并旋紧装置，将其颠倒混匀，使样本与裂解液在装置的混匀区内充分混匀，并于室温静置10min； 痰液及脓性样本裂解前需要液化：痰液需首先目测标本，若唾液占绝大部分，则需重新采集标本；将合格痰液转移至痰瓶中，加入1倍体积的4%NaOH充分震荡混匀 （视液化情况而定,可多加4%NaOH，但不可超过2.5倍），室温下放置5min-10min左右液化；其它样品则无需液化。 将口腔咽部、阴道分泌物、前列腺分泌液等样本用棉签取得后放在含有1mL生理盐水的1.5mL离心管中洗脱。取1mL洗脱液通过进样口放入已含有1mL裂解液的样本前处理装置中，盖上盖子并旋紧装置，将其颠倒混匀，使样本与裂解液在装置的混匀区内充分混匀，并于室温静置10min； 过滤：用力挤压样本前处理装置，将装置内的混合液通过出样口挤到一个5min离心管内； 吸附：利用微量核酸提取装置（已连接注射器）缓慢吸取上述滤液，样品完全经过滤膜后，再将滤液经过滤膜重新推出，弃掉； 清洗： 利用上述微量核酸提取装置吸取清洗液Ⅰ1mL，待清洗液完全经过滤膜后，再将滤液经过滤膜重新推出，弃掉； 利用上述微量核酸提取装置吸取清洗液Ⅱ1mL，待清洗液完全经过滤膜后，再将滤液经过滤膜重新推出，弃掉；用注射器缓慢抽推空气几次。 取下注射器，将微量核酸提取装置常温静置10min，最后再将注射器和微量核酸提取装置连接，用注射器吸满空气再经滤膜推出，以便充分去除膜中清洗液Ⅱ。 洗脱：用微量移液器吸取200μL 洗脱液在0.6mL离心管内，使洗脱液来回经过滤膜三次，最后将收集的洗脱液保存，供核酸扩增使用。  （规范性附录） 微量核酸快速提取装置 样本前处理装置 （规范性附录）溶液配制 裂解液 120g 异硫氰酸胍溶解于100mL 1mol/L Tris-HCl (pH=6.4) 中，随后加入22mL 0.2mol/L EDTA (pH=8.0)，混匀即可。配完后的液体体积约为220mL，