橡胶草3―羟基―3―甲基戊二酰辅酶A基因表达初步分析.docVIP

橡胶草3―羟基―3―甲基戊二酰辅酶A基因表达初步分析 　　摘要：分析橡胶草HMGR基因的表达情况，构建原核表达载体，转化BL21菌株并诱导表达。构建细胞融合表达载体，转化GV3101菌株并侵染洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察基因表达情况。构建植物过表达载体并侵染烟草，利用紫外分光光度法检测三萜含量的变化。通过IPTG诱导和SDS检测，获得分子量为62659 1 ku的蛋白，与预期蛋白相符合，且37 ℃诱导6 h时表达最明显；通过激光共聚焦显微镜观察，该基因主要在细胞膜上表达；紫外可见分光光度法表明转基因烟草中三萜的含量高于空白烟草。橡胶草HMGR基因分别在大肠杆菌、洋葱鳞片内表皮和烟草中成功表达。 　　关键词：橡胶草；HMGR基因；原核表达；亚细胞定位；总三萜提取物 　　中图分类号： Q786文献标志码： 　　文章编号：1002-1302（2017）16-0042-04 　　收稿日期：2016-03-31 　　基金项目：国家自然科学基金（编号。 　　作者简介：赵李婧（1989―），女，山西晋城人，硕士研究生，主要从事植物基因工程的研究。E-mail：851409674@qqcom。 　　通信作者：闫洁，博士，副教授，主要从事生物化学和分子生物学教学和科研工作。E-mail：1653842328@qqcom。 　　天然橡胶的生物合成是通过产胶植物体内的异戊二烯代谢途径完成的，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMGR）基因及其启动子是该代谢途径中的关键限速酶基因，它控制着碳流的流向和代谢反应速率，也是萜类化合物代谢调控的重要位点。目前，已经从橡胶树、水稻、甘草、皂苷、阳春砂、三七、雷公藤、拟南芥、番茄、杜仲等植物中克隆得到了该酶的基因及其启动子，它们以基因家族的形式存在并控制着代谢途径中产物的合成[2-11]。研究发现，HMGR基因在萜类化合物合成中起着关键的调节作用，例如转拟南芥[WTBX][STBX]HMGR1[WTBZ][STBZ]基因的番茄中植物淄醇含量增加到24倍[12]。烟草已具备了成熟的遗传转化体系，是研究基因功能的理想模式植物。从橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）中克隆得到的HMGR基因是橡胶产胶代谢途径中的关键限速酶基因，为了进一步研究橡胶草的HMGR基因功能，本研究构建了HMGR基因的原核表达载体和植物过表达载体，转化DE3大肠菌株、在洋葱鳞片叶表皮瞬时表达，并通过农杆菌叶盘转化法转化烟草，以便进一步研究该基因在异戊二烯代谢途径中的功能，并为研究产胶代谢调控机理奠定基础。采用基因工程的方法，对橡胶草HMGR基因的原核表达、亚细胞定位和真核表达进行了分析，为进一步揭示基因的功能和为后续研究奠定了基础。 　　1材料与方法 　　11试验材料 　　111材料 　　橡胶草植株，于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖旁边，后移栽至实验室栽培室进行室内培养；“NC89”野生型烟草，由笔者所在实验室提供；齐墩果酸标准品，购自北京全式金生物技术有限公司；新鲜生长良好的洋葱，购自石河子蔬菜市场。 　　112菌株、质粒及试剂 　　大肠杆菌Top10、农杆菌GV3101、植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS、细胞融合表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，均由笔者所在实验室保存。植物总RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；SuperRT cDNA Kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；Blue Plus Ⅲ Protein Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；引物均由华大基因合成，其他试剂均为国产或进口分析纯。 　　113仪器 　　冷冻干燥机LGJ-10C、紫外-可见分光光度计、激光共聚焦显微镜IN Cell Analyzer 3000，均购自上海分析仪器厂。 　　12试验方法 　　121原核表达载体的构建 　　为了研究该基因的蛋白表达情况，构建了原核表达载体。将PET-30a质粒和pGEMT-T-HMGR 质粒分别用BamHⅠ和SalⅡ进行双酶切，酶切体系为20 μL，7 μL质粒、2 μL 10×T buffer、BamHⅠ和SalⅡ各 1 μL，然后加无菌水至20 μL，将反应体系置于37 ℃水浴中酶切4 h，4 h后跑核酸电泳检测。切胶回收PET-30a（+）载体片段和TkHMGR基因片段，将回收的片段用T4 DNA连接酶连接，连接体系为10 μL，PET-30a（+）和TkHMGR各 4 μL、1 μL 10×Loading buffer、1 μL T4 DNA?B接酶，反应体系置于4 ℃水浴过夜连接，将连接产物转化Top10感受态细胞，在添加了卡那霉素（Kan）的LB固体培养基