欧文氏杆菌CXJZ1101基因组文库构建.docVIP

欧文氏杆菌CXJZ1101基因组文库构建 　　 (中国农业科学院麻类研究所，长沙410205) 　　 　　摘要：采用改良鸟枪法构建了草本纤维精制高效菌种CXJZ11－01的基因组文库，通过透明圈法筛选到了2个木聚糖酶基因阳性克隆#65377; 　　关键词：欧文氏杆菌CXJZ11－01；，基因组文库；木聚糖酶基因 　　中图分类号：Q939．121；Q78文章标识码：A文章编号：0439－8114(2008)06－0619－03 　　 　　Genomic Library Construction of Erwinia carotovora CXJZ11－01 　　 　　SHI Jun，LIU Zheng－chu，CHENG Li－feng，DUAN Sheng－wen，ZHENG Ke，FENG Xiang－yuan，HU Zhen－xiu 　　(Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China) 　　 　　Abstract：By using shot－gun method，the genomic DNA library of the efficient herbaceous extraction strain E．carotovora CXJZ11－01 was constructed．Using the method of transparent circle to the positive clones， theidentical xylanase genes was identified． 　　Key words： E．carotovora CXJZ11－01；genomic library；xylanase gene 　　 　　木聚糖是半纤维素的主要成分之一，是自然界中仅次于纤维素的第二大生物质资源[1]#65377;木聚糖酶是木聚糖的专一降解酶，属于水解酶类，包括内切木聚糖酶#65380;外切木聚糖酶和木糖苷酶3种#65377;木聚糖酶主要来源于微生物，可产木聚糖酶的微生物主要有：细菌[2，3]#65380;放线菌[4，5]#65380;真菌(包括链霉菌)[5]和酵母菌等[6－8]#65377;国内研究最多的是木霉菌株T6#65380;青霉#65380;黑曲霉#65380;棒曲霉#65377;20世纪70年代末有许多国家开展了木聚糖酶基因克隆的研究，目的在于提高微生物分泌木聚糖酶的表达量#65377;Bernier[9]等从Bacillus Subrilis PAPII5中克隆到第1个木聚糖酶基因以来，至今已经有近百种不同微生物来源的菌株的木聚糖酶基因被克隆，并在大肠杆菌及酵母等各种宿主菌种中表达[10]#65377;尽管国外已有许多来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达的报道，但真正用于木聚糖酶生产的基因工程菌株还不是太多#65377;本研究通过建立欧文氏杆菌CXJZ11－01基因组文库，采用透明圈法[11]，筛选木聚糖酶基因阳性克隆，克隆和研究该菌种木聚糖酶基因#65377; 　　 　　1材料与方法 　　 　　1．1材料 　　欧文氏杆菌CXJZ11－01#65380;E．coli DH5a及载体pUC18由本实室保存#65377;Lambda Hind－III Fragment， DNA DL2，000 Marker，10×GC Buffer，dNTPs，r－TaqDNA聚合酶，购自TaKaRa公司#65377;E．Z．N．A Plasmid Miniprep Kit II，E．Z．N．A Gel Extraction Kit，购自Omega公司#65377;木聚糖购自Sigma公司#65377;其他试剂均为国产分析纯#65377;引物由上海生工合成#65377; 　　1．2方法 　　1．2．1菌种的培养挑取保存菌种涂平板，35℃过夜培养，挑选典型菌落接种至LB培养基，35℃扩大培养6 h左右，取少量接种至发酵培养基或直接作为研究材料#65377; 　　1．2．2欧文氏杆菌CXJZ11－01基因组DNA提取培养5 mL细菌培养物至饱和，取1．5 mL培养物离心2 min，沉淀物加567 μL的TE缓冲液重悬#65377;加30 μL 10%SDS和3 μL 20 mg?mL－1的蛋白酶K，混匀，37℃温浴1 h，加100 μL 5 mol?L－1 NaCl，充分混匀，再加80 μLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃温浴10 min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，离心4~5 min，留上清，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇