2提质粒_分子生物学实验.pptVIP

1.2.2 实验程序 任务分配： A1和B1提取pET28a质粒 A2和B2提取pEGFP-N3质粒 2、细菌裂解及质粒的提取 将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。 加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上5min。 加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置5min。 12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。 4、质粒的浓缩 加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10min。 12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清液, 空气中干燥5－10min。 * 实 验 一 质粒DNA的提取及鉴定 背景理论知识 Section 1 掌握质粒信息和用途，学会自己看质粒图谱 掌握快速提取小量质粒DNA的方法 了解质粒DNA提取的基本原理 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法 1.1.1 实 验 目 的 1.1.2 载 体 定义：基因工程中携带目的基因进入宿主 细胞进行扩增和表达的工具。 类型：大肠杆菌中的质粒、?噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。 载体的基本条件 复制子：一段具有特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制。 可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。 限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基因的插入。 适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。 1.1.2 载 体 质 粒 载 体 是染色体外小型的双链环状的DNA，常用载体之一 自我复制 具有合适的限制酶切位点 筛选标记 可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外的特性 高拷贝数 小分子量1-200Kb 高稳定性 1.1.2 载 体 克隆载体 表达载体 原核 真核 穿梭载体 pGEM-T, pENTR pET28a(+), pGEX, pMAL pcDNA3.0, pEGFP-N3, pRK 质 粒 载 体 的分类 根据用途分类 1.1.2 载 体 质粒（原核载体） 1.1.2 载 体 1.1.2 载 体 质粒（真核载体） 1.1.2 载 体 1.1.3 质粒提取一般步骤 细菌培养物的生长 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化 质粒提取的常用方法 碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同） 苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布） CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同） SDS 裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清） 玻璃纤维膜法(试剂盒) 1.1.3 质粒提取 碱裂解法提取质粒DNA [目的要求] 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。 1.1.3 质粒提取 [实验原理] 根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。 当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。 碱裂解法提取质粒DNA 1.1.3 质粒提取 实验操作 Section 2 1.2.1 实验材料 含质粒载体（pET28a）和含目的基因质粒（pEGFP-N3）的大肠杆菌DH5a 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8 .0） 溶液II 0.4 mol/L NaOH， 2% SDS（用前等体积混合） 溶液III 5 mmol/L 乙酸钾 ， 冰乙酸 ，H2O 苯酚：氯仿（25：24） 氯仿：异戊醇(24：1) 无水乙醇， 70%乙醇(-20?C保存) TE缓冲液: 10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶 1.2.1 实验材料 1、细菌培养和收集 将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。（已完成） 取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中, 10000rpm离心1m