柔嫩艾美耳球虫江苏株SAG10基因克隆及分析.docVIP

柔嫩艾美耳球虫江苏株SAG10基因克隆及分析 　　摘要：根据GenBank中已发表的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella） SAG10基因序列，利用计算机软件设计1对引物，从E. tenella江苏株的第2代裂殖子中成功克隆出SAG10基因。将该基因与GenBank中国内外不同E. tenella分离株的SAG10基因进行比对，发现E. tenella江苏株与北京株的SAG10基因同源性最高，高达99%，其后依次为杨凌株、豪顿株。4种不同分离株SAG10基因的ORF之间有11个碱基不同，其中3个为无义突变，8个为有义突变。分析4种分离株SAG10基因推导蛋白质的亲水性、抗原指数、表面可及性发现，国内外不同E. tenella分离株SAG10蛋白的抗原性总体比较接近且很强，但国内不同分离株之间的抗原性更加接近，并优于国外的豪顿株，这可能是由于氨基酸突变引起蛋白质的空间构象和亲水性等发生变化而引起。将上述SAG10基因序列与复顶门原虫的其他相关SAGs基因序列进行遗传进化分析，发现Eimeria属球虫SAGs基因之间相对比较保守，且与犬新孢子虫（Neospora caninum）、N. hughesi、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）的SAG基因之间同源性较低，与已有观点一致；但神经肉孢子虫（Sarcocystis neurona）的2条SAG1基因序列却与E. tenella的SAG1基因序列表现出更高的同源性，这与其他研究结论不符。 　　关键词：柔嫩艾美耳球虫；SAG10基因；克隆；分析 　　中图分类号： Q785文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）03-0024-04 　　鸡球虫基因克隆始于1987年，迄今已有240多个基因被成功克隆，鸡球虫的重组疫苗也得到了广泛研究[1]。有分析认为，参与艾美耳球虫宿主细胞入侵过程的相关分子是最具应用潜力的保护性抗原，如子孢子和裂殖子表面抗原（surface antigens，简称SAGs）以及微线、棒状体、折光体等分泌型亚细胞器的分泌蛋白[1-2]。柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）表面抗原SAG10（surface antigen 10）是一种C端具有疏水性的糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，简称GPI）锚定结构域的表面蛋白[3]。由于SAG10基因在E. tenella子孢子和第2代裂殖子阶段均有表达，且SAGs被认为在启动顶复门原虫识别、黏附和侵袭宿主细胞、免疫调节、免疫逃避、宿主特异性等方面均发挥着重要作用，因此国外很多学者正加大对SAG10等表面抗原的研究力度[3-6]。韩德强等[7]、麦博等[2]分别对E. tenella北京株、杨凌株的SAG10基因进行了研究，但目前尚无对E. tenella江苏株SAG10基因进行研究的报道。麦博等研究发现，SAG10在不同E. tenella株间存在抗原性差异，这与认为E. tenella不存在明显株间抗原性差异的传统观点相对立[2]。本研究通过对E. tenella江苏（Jiangsu）株的SAG10基因进行克隆，并将其与国内外学者在GenBank中公布的E. tenella豪顿（Houghton）株、北京（Beijing）株、杨凌（Yangling）株的SAG10基因进行比对和分析，为研究 E. tenella SAG10的生物学功能、筛选E. tenella保护性抗原等工作提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1球虫卵囊 　　E. tenella分离自江苏省某鸡场，由南通市出入境检验检疫局有害生物检疫实验室鉴定并保存。 　　1.1.2试验鸡 　　1日龄AA肉鸡，购自江苏省南通市某商品鸡孵化场，饲养于严格消毒且无球虫的笼舍中，饲料中不含抗球虫药。 　　1.1.3试剂 　　焦碳酸二乙酯（DEPC），购自Amresco公司；莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）、Oligo（dT）15 Primer，?自Promega公司；pMD18-T克隆载体、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2 000 Marker、限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、DNA胶回收试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1引物设计与合成 　　根据Tabares等在GenBank中发表的E. tenella SAG10基因序列[3]（登录号：AJ586552），利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性扩增引物，上游引物为5′-CA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]ATGCTACAGCGGAAGCTAC-3′，下游引物为5′-TG[ZZ（Z]GAATT