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次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型ZY05719基因转录谱影响 　　摘要：次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）是猪链球菌2型的毒力相关因子，该基因的丢失降低了猪链球菌2型菌株ZY05719黏附HEp-2、PK15细胞的能力。为全面掌握IMPDH对ZY05719致病力的影响机制，采用定制的Agilent猪链球菌2型基因表达谱芯片，比较了亲本菌株ZY05719（ZY）和impdh敲除菌株（ΔZY）的基因转录情况。结果显示，impdh的丢失影响了254个基因的转录，其中包括impdh的下调基因177个，上调基因77个。对差异基因进行同类群聚类（Clusters of Orthologous Groups，COG）分析，显示差异基因主要集中于氨基酸、碳水化合物的转运代谢，以及核糖体、细胞壁、细胞膜的生物合成和防御机制。本研究较为全面地分析了impdh对猪链球菌2型基因转录谱的影响，为解释impdh在猪链球菌致病中发挥的作用提供了数据支持。 　　关键词：猪链球菌2型；表达谱芯片；同类群聚类；次黄嘌呤核苷酸脱氮酶；基因转录谱 　　中图分类号： S858.285.1+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0027-03 　　猪链球菌（Streptococcus suis）是有荚膜的革兰氏阳性球菌，是世界范围内流行的一种重要的猪病原菌[1]，该菌往往引起保育猪或断奶仔猪发生脑膜炎、败血症、关节炎[2]。依据荚膜多糖抗原可将S. suis分为33个血清型（包括1～31、33、1/2型）[3]，其中S. suis 2致病力最强、流行范围最广，并且能够引起人发生脑膜炎和严重的毒性休克综合征[4-6]。1998、2005年分别在我国江苏省、四川省部分地区暴发了人感染猪链球菌病，病原菌即为猪链球菌2型[7]。S. suis已成为越南南部地区成人细菌性脑膜炎的主要病因[8]，人可通过与发病猪的直接接触感染S. suis，而人与人之间的传播目前尚未得到证实。对S. suis 2的研究陆续发现了荚膜、溶血素、纤连蛋白结合蛋白、血清浑浊因子等毒力相关因子[9]。笔者所在研究室的前期工作中，对SS2-H、ZY05719菌株的impdh基因进行敲除，发现与亲本株相比，缺失株对猪的致病力均有所下降，提出IMPDH为S. suis 2的毒力相关因子[10-11]，但IMPDH对S. suis 2致病力的影响还缺少系统性认识。本研究采用猪链球菌2型的表达谱芯片，比较了亲本菌株ZY05719（ZY）和impdh敲除菌株（ΔZY）的基因转录谱，并对差异基因进行了归类分析。 　　1材料与方法 　　1.1细菌培养 　　本研究涉及2株猪链球菌2型菌株，包括强毒菌株ZY、ΔZY。ZY为2005年分离自四川省资阳市发生猪链球菌病的猪组织（由南京农业大学动物医学院微生物组惠赠）；ΔZY为敲除impdh的ZY菌株，由笔者所在研究室构建获得。 　　细菌在THB（Todd-Heitt broth，BD）平板上进行培养，无菌挑取菌落进入THB液体培养基中，于37 ℃下培养过夜。将此培养物按照1%的接种比例接入新的THB液体培养基中，于37 ℃下培养至细菌对数生长期，革兰氏染色观察细菌形态。 　　1.2RNA提取和纯化 　　采用TRIzol Reagent（Life technologies，US）并根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的细菌总RNA抽提。采用Biomate 3S型超微量紫外可见分光光度计（Thermo，US）测定抽提所得总RNA样品的浓度及D260 nm/D280 nm比值，另外经Agilent Bioanalyzer 2100型电泳（Agilent technologies，US）质检合格后使用RNeasy mini kit（Qiagen，Germany）和RNase-Free DNase Set（Qiagen，Germany），纯化总RNA。 　　1.3样品RNA的放大和标记 　　采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒、Low RNA Input Linear Amplification kit（Agilent technologies，US）、5-（3-aminoallyl）-UTP（Ambion，US）、Cy3 NHS ester（GE healthcare Biosciences，US），按照标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit（QIAGEN，Germany）纯化标记后的cRNA。 　　1.4芯片杂交 　　依据SS2-05ZYH33菌株基因序列，定制Agilent公司的8×15 kbp表达谱芯片，该芯片包含2 178个探针（每个探针含60个碱基）。按照Agile