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植物免疫系统中RNAi作用机制和应用 　　摘要RNAi作为广泛存在于生物中的一种古老现象,是生物抵抗异常DNA的一种保护机制,在植物体内充当免疫系统的角色。就RNAi的作用机制及其在植物抗病毒方面的应用进行了综述。 　　关键词RNAi;植物免疫;作用机制;应用 　　中图分类号Q352文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)14-0354-01 　　 　　RNAi是通过双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导特异性地降解靶mRNA,使靶基因发生沉默;RNAi作为广泛存在于生物中的一种古老现象,是生物抵抗异常DNA的一种保护机制。它可以识别外来DNA分子,使之沉默,并且稳定和放大这种应答,是植物体内的免疫系统,抵御着病毒等异常DNA的入侵。 　　 　　1RNAi的发现 　　 　　1990年Napoli等[1]向矮牵牛中导入多拷贝查尔酮合成酶基因以期产生颜色更深的紫色矮牵牛花,结果许多花朵的颜色不但没有加深,反而变成白色或花白色;他把这种奇怪的现象称为“共抑制”。1995年,康乃尔大学的Guo和Kempheus[2]利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断线虫(C. elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sen se RNA)相反的结果,但结果却令他们费解:二者同样阻断了par-1基因的表达途径。直到1998年,Fire和Mello等[3]首次将正义链和反义链的混合物注入线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默(gene silencing)。将这种现象称为RNA干扰(RNA in terference,RNAi)。随后,RNAi现象在真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、小鼠等大多数真核生物中广泛地发现。 　　 　　2RNAi的分子机制 　　 　　RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象,是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制,同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色,它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在酶的作用下,形成约22个碱基大小的小干扰RNA(small inte-rfering RNAs,siRNAs),siRNAs可进一步掺入多组分核酸酶(multicomponent nuclease)并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。RNAi机制过程中一种被称为Dicer的酶首先被鉴定出来,它是RNase Ⅲ家族中特异识别双链RNA的一种。Dicer 能将长的双链RNA切割降解为19～23个碱基长的小分子干扰核糖核酸(siRNA)。这是一个依赖ATP的耗能过程,切割后的siRNA 3′具有2个核苷酸TT突出末端。然后siRNA结合到核糖核酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC。活化的RISC通过由siRNA决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的基因转录体,最终导致基因沉默效应(图1)[4]。 　　解开siRNA的双链后,反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物,以mRNA为模板,在RISC中的RNA依赖RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerases,RdRPs,又称作RDRs)的作用形成新的dsRNA,再次被Dicer 识别并切断,形成新的siRNA再循环作用于另外的靶向mRNA。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA,使RNAi作用在短时间内达到迅速并有效地抑制mRNA翻译形成蛋白质或多肽,从而有效地抑制了靶向基因蛋白质或多肽的合成[5]。 　　除上述转录后基因沉默外,还有转录水平的基因沉默。反向重复的基因或转基因,无论它们是紧密相连,还是被其他序列隔开,都可以进行异位配对,配对的DNA作为信号导致一系列反映,包括甲基化、异染色质化[6]或RNA的降解,最终造成基因不能正常表达。通过抑制重复序列的转录产物,RNAi引导异染色质形成,阻碍有可能换位的成分和其他外源DNA整合到基因组[7],这是外源基因插入后生物体的一种自我保护。 　　 　　3利用RNAi产生抗病毒植物 　　 　　RNA干扰现象本身就是植物天然的病毒防御系统。利用转基因技术将与病毒同源的dsDNA的hpRNA载体整合到植物基因组,表达后就会引起病毒基因组的特异性降解,阻止病毒的复制扩散,获得稳定遗传的抗病毒植物。1998年,Waterhouse等[8]利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构