饲料中克伦特罗和莱克多巴胺的测定.DOCVIP

DB43/T 437-2009 DB43/T 437-2009 PAGE 4 PAGE 3 饲料中克伦特罗和莱克多巴胺的测定 高效液相色谱法 1　范围 本标准规定了饲料中克伦特罗和莱克多巴胺含量测定的高效液相色谱法（HPLC）。 本标准适用于配合饲料、预混饲料中克伦特罗和莱克多巴胺含量的测定。 2　规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682－1992　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1　饲料　采样 ３　原理 用酸性甲醇－水溶液提取样品中的克伦特罗和莱克多巴胺，阳离子交换固相萃取柱净化,用配有双波长紫外检测器或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪分离测定，外标法定量。 4　试剂与材料 本法所用试剂除另有说明外，均为分析纯；水为符合GB/T 6682-1992规定的一级水。 4.1　乙酸乙酯。 4.2　异丁醇。 4.3　乙腈，色谱纯。 4.4　甲醇。 4.5　正己烷。 4.6　磷酸：优级纯。 4.7　4.0mol/L氢氧化钠溶液：称取40.0g氢氧化钠，用水稀释至250mL。 4.8　提取液：0.1mol/L盐酸－甲醇溶液（9＋1，V+V）。 4.9　乙酸乙酯＋异丁醇（3＋7，V+V）。 4.10　甲醇+水（4+6，V+V）。 4.11　0.2％冰乙酸：移取100uL冰乙酸加入到50mL容量瓶中，用水稀释到刻度。 4.12　5％氨化甲醇：准确量取5ml氨水和95ml甲醇，混匀后备用。 4.13　流动相：乙腈+5mmol/L磷酸二氢钾溶液【用磷酸（4.6）调pH3.0】＝ 23+77（V+V)。 4.14　克伦特罗标准品：纯度≥98% 。 4.15　莱克多巴胺标准品：纯度≥98%。 4.16　标准储备液（250mg/L）：准确称取已知纯度的克伦特罗标准品25mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度；准确称取已知纯度的莱克多巴胺标准品25mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度。作为储备液贮于4℃冰箱中。临用前根据需要用甲醇+水（4.10）将标准储备液稀释成适当浓度的混合标准工作液。 4.17　固相萃取柱：阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯/二乙烯苯聚合物，60 mg，3 ml，或相当者。 5　仪器与设备 5.1 分析天平：感量0.01g、0.01 mg。 5.2 超声波清洗器。 5.3 离心机：转速能达到8000r/min。 5.4 氮气吹干仪。 5.5 高效液相色谱仪：配有双波长紫外检测器或二极管阵列检测器。 6　样品制备 按GB/T 14699.1规定，取有代表性的样品，四分法缩减取约200g，经粉碎，全部过1mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1　试样提取及净化 准确称取一定量的样品（配合饲料5.0 g，预混饲料2.0 g），置于50 ml离心管中，准确加入25.00 ml提取液（4.8），涡旋振荡5min，超声器中超声20 min，离心（8000 r/min）10min，准确移取上清液5.00ml于25ml离心管中。 加入正己烷5ml于上述溶液中，振荡去脂，弃去上层液，重复一次。下层液用氢氧化钠溶液（4.7）调pH为10.5，乙酸乙酯＋异丁醇（4.9）10ml振荡萃取，重复一次，合并上层有机相，60℃下氮气吹至近干，加入2ml盐酸－甲醇溶液（4.8）涡旋溶解，备用。 取固相萃取柱，依次用3 ml甲醇、3ml水、3 ml 0.2％冰乙酸活化。将上述备用溶液加到已活化好的固相萃取柱中，分别用3 ml 0.2％冰乙酸、3ml水、3 ml甲醇淋洗，弃去淋洗液。用3mL 5％氨化甲醇（4.12）洗脱，控制流速1 mL/min。收集洗脱液，50℃下用氮气吹干。准确加入1.00 ml甲醇+水（4.10）溶解，0.45μm的微孔过滤膜过滤，待测。 7.2 HPLC测定 7.2.1 液相色谱仪参数 液相色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm或相当者。 流动相：见4.13。 流速：1 mL/min。 进样量：20～30 μL。 柱箱温度：40℃。 检测波长：克伦特罗243 nm、莱克多巴胺276nm。 7.2.2 液相色谱仪测定 分别将克伦特罗和莱克多巴胺混合标准工作溶液及样品溶液注入液相色谱仪，采集色谱图，按外标法以峰面积进行计算。 标准品色谱图见附录A。 7.3 结果计算 样品中克伦特罗或莱克多巴胺的含量由色谱数据处理软件或按下式计算获得： 式中： X ——样品中克伦特罗或莱克多巴胺的含量，单位为毫克每千克