RPA技术和其在食品检测中应用.PDFVIP

RPA 技术及其在食品检测中的应用 杜小林 16302010082 概述： 重组酶聚合酶扩增技术 (recombinase polymerase amplification, RPA)是 以 T4 噬菌体的核酸复制机制为基本原理，模仿细胞内的核酸复制机制的一种新 兴恒温核酸扩增技术。 该技术主要依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换 DNA 聚合酶进行常温下的核 酸扩增，是一种可以替代传统 PCR 的新型核酸检测技术。利用该技术能够在 15 分钟内进行常温下的单分子核酸检测。且该技术对硬件设备的要求很低，适合用 于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。 技术原理： 反应体系： 重组酶（如 T4 uvsX、E.coli recA 等）、单链核酸结合蛋白（如 T4 gp32 等）和链置换 DNA 聚合酶（如 B.subtilis Pol I、S.aureus Pol 等），寡核苷 酸引物、DNA 模板，以及T4 uvsY 和 Carbowax20M 等成分 （用于改变重组酶-引 物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于 RPA 的进行）。 反应原理： a) 重组酶与长约 30-35nt 的引物结合形成的复合物在双链 DNA 模板中寻找靶 位点; b) 复合物在模板上定位后可以直接引发链交换反应形成 D-Loop 结构，单链 结合蛋白随即结合被置换的 DNA 链，稳定形成的 D-Loop 结构并且防止引 物解离; c) 重组酶-引物复合物主动水解体系中的 ATP 导致复合物构象改变，重组酶解 离后引物 3端暴露并被 DNA 聚合酶识别，DNA 聚合酶按照模板序列在引物 3末端添加相应碱基，DNA 扩增启动； d) 链置换 DNA 聚合酶在延伸引物的同时继续解开模板的双螺旋DNA 结构，DNA 合成过程继续进行； e) 两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子； 反应条件： a) 引物与探针的设计：RPA 反应中引物和探针的设计是决定 RPA 反应能否成 功进行的关键。RPA 所用引物一般在 18 bp~35 bp 之间，通常比PCR 引物 要长。如果引物过短会降低反应重组率，引物过长则有可能形成二级结构。 引物的浓度应该根据模板的浓度进行多次筛选，以确定最佳浓度，提升扩 增速率。一般来说，引物的浓度范围在 400~500 nmol/L 之间。 b) Mg2+的浓度：RPA 反应体系中 Mg2+的浓度可对反应结果产生很大影响。最 佳 Mg2+浓度可在 12-20 nmol/L 的范围内进行筛选确定。Mg2+是 RPA 反应 的启动因子，一旦Mg2+进入反应体系，扩增反应就会开始。因此，Mg2+应 最后加入反应体系。根据 Mg2+的加入时间即可得到RPA 的反应时长。 c) 模板 DNA 的长度：模板 DNA 的长度也会对RPA 的扩增结果产生影响。80~400 bp 长度的模板链是目前 RPA 反应中最优的模板链长度。在模板DNA 片段 过长或多重复时，RPA 技术的准确度会降低。 d) 反应温度： 虽然在 RPA 技术中变性温度不再是比较重点，但温度仍是影响 RPA 反应的一个关键因素。RPA 反应的适用温度为 31℃~43℃之间。温度为 31℃反应 20 min 的阳性检测率即可达 100%。温度在 25℃~30℃时，反应 20 min 内的出现假阳性。 技术应用： RPA 技术具有灵敏度高、特异性强、操作快速便捷等优点，而且可以实现定 量分析，因此在疾病诊断、病原鉴定、食品安全检测等多方面都有广阔的应用前 景。这里主要分析其在食品检测中的应用。 a) 食品微生物检测：微生物检测对食品安全具有极大意义。目前 RPA 在这方 面的应用有 —— 用于检测食品中的有害微生物的 direct-RPA 检测体系， 这种检测体系可于 30 分钟内检测出 3.2 μL 样品中的 4 个有害菌样本， 具有快速、灵敏性高、检测样本度宽等多项优点。以及多重实时荧光定量 RPA 体系，在 20 min 内定量检测鸡蛋及禽类样品中的弯曲杆菌及曲菌的 污染情况，这种方法比 qPCR 体系或者 LAMP 体系具有更高的灵敏度、更短 的时长