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甘蓝型油菜离体培养再生体系优化 　　摘要：为优化甘蓝型油菜离体培养再生体系，本研究分析了影响再生频率的多个关键因素，包括品种、外植体类型、苗龄、预培养时间以及激素浓度与配比等。结果表明：品种对再生频率影响较大，Westar的外植体再生频率高于宁油18号和中双11号；不同外植体再生频率也存在差异，子叶柄的再生频率显著高于下胚轴；苗龄以4 d较好，预培养时间以2 d较适宜；预培养基中激素2，4-D最适浓度为1 mg/L，分化培养基中，6-BA/NAA比例为10 ∶ 1时子叶柄的再生频率最高，为70.79%，6-BA/NAA比例为9 ∶ 1时下胚轴的再生频率最高，达到96.73%。经过优化后，油菜外植体再生频率得到显著提高。 　　关键词：油菜；离体培养；再生；优化；影响因素 　　中图分类号： S634.304+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0076-04 　　油菜为世界第二大油料作物[1-3]，也是我国重要油料作物之一，在人类的生活和农业生产上有着极其重要的作用。油菜花具有一定观赏价值，可用作旅游资源；油菜的茎叶可食用，还可用来饲养动物；油菜种子不仅可用来榨取食用油，饼粕还可用来做饲料。此外，油菜属于可再生资源，低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳链组成与柴油分子碳数相近，因此被认为是生物柴油最理想的原料[4]。当今育种学家把提高油菜产量和品质，培育抗病和抗逆油菜新品种作为重要内容来研究[5]。 　　目前，组织培养技术被广泛地应用到油菜育种中[6]，并得到了大量不同优良特性的油菜种质资源[7-12]。高效的植株再生体系是油菜基因工程育种中的重要环节。在已有的研究报道中[13-18]，油菜可用下胚轴、子叶柄、根、茎、小孢子等作为外植体来进行组织培养。经过多年研究，国内外许多机构已建立了较为成熟的油菜离体培养再生体系[19-21]。然而，研究表明，在油菜组织培养中，不同基因型、不同外植体之间的最佳再生条件存在差异，这在一定程度上阻碍了油菜转基因研究的发展。本研究主要对影响油菜离体培养再生体系的关键因素进行分析，以期摸索出一套稳定、高效的油菜遗传转化体系，为油菜组织培养提供基础数据，并进一步为通过植物转基因技术获得预期优良性状的油菜新种质奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试油菜品种有Westar、宁油18号、中双11号，由江苏省农业科学院经济作物研究所提供。 　　1.2 试验方法 　　本试验主要研究油菜离体培养再生体系的关键影响因素，包括：品种、外植体类型、苗龄、预培养时间、激素浓度和配比等。其中品种有3个，即：Westar、宁油18号、中双11号；外植体类型包括子叶柄和下胚轴；苗龄分为4、5、6 d，预培养时间分为1、2、3 d；2，4-D浓度分别为0.5、1.0、1.5 mg/L；在固定NAA或6-BA浓度的基础上（NAA基本浓度为0.4 μmol/L，6-BA基本浓度为4 μmol/L），将6-BA/NAA的配比分别调整为9 ∶ 1、10 ∶ 1、11 ∶ 1。以期从上述组合中筛选出最适合的油菜离体培养再生体系。 　　1.3 培养基配方 　　无菌苗生长培养基：1/2MS+20 g/L蔗糖+0.8%琼脂，pH值5.8；预培养基：MS+1.0 mg/L 2，4-D+9.8 μg/L AS（乙酰丁香酮），pH值5.8；芽诱导培养基：MS+0.4 μmol/L NAA+4 μmol/L 6-BA+0.2 g/L PVP（聚乙烯比咯烷酮）+5 μmol/L MES（乙-吗啉乙磺酸）+200 μmol/L AdSO4（硫酸腺嘌呤）+15 μmol/L AgNO3+250 mg/L Carb（羧苄青霉素）+0.2 μmol/L GA3+30 g/L 蔗糖+2 g/L Gelrite（植物凝胶），pH值5.8；MS培养基：MS+30 g/L 蔗糖+250 mg/L Carb +2 g/L Gelrite，pH值5.8。 　　1.4 离体培养程序 　　1.4.1 无菌苗培养 取大离心管1支，倒入种子，加适量的“84消毒液”灭菌，不停振荡20 min，再用无菌水冲洗5遍，每次30 s。清洗完的种子铺在MS培养基中，每瓶培养基50～60粒，然后将培养瓶在（25±1） ℃黑暗条件下培养3 d。后移至光下培养1 d，在25 ℃、光照度为2 000 lx、16 h/d光照条件下培养，待用。 　　1.4.2 预培养 将培养4～6 d的无菌苗，在底部放置了MS湿润滤纸的灭菌培养皿中，用解剖刀切下2个子叶中较大的子叶柄和下胚轴，下胚轴切成5～10 mm的小段，将切下的外植体置于预培养基上预培养2 d。 　　1.4.3 芽诱导培养 预培养后，将外植体转入芽诱导培养基中，在强光照下2