甘草总黄酮及其成分异甘草素调控M2型巨噬细胞极化机制研究.docVIP

甘草总黄酮及其成分异甘草素调控M2型巨噬细胞极化机制研究 　　[摘要]考察甘草总黄酮（TFRG）及异甘草素（ISL）对M2型巨噬细胞的调控机制。利用IL-4（60μg?L-1）诱导鼠源RAW264.7巨噬细胞6h为M2型巨噬细胞。TFRG及ISL在Trans-well小室迁移实验中减弱因M2型巨噬细胞导致乳腺癌4T1细胞的体外迁移力提高。TFRG和ISL呈剂量依赖性抑制精氨酸酶1（Arg-1）在基因和蛋白水平的表达，并提高血红素加氧酶1（HO-1）的基因表达，同时提高诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表达，提高microRNA-155及其靶基因之一SHIP1的表达，并降低信号转导及转录活化因子3和6（STAT3/6）蛋白磷酸化水平。TFRG及其成分ISL是甘草抑制巨噬细胞向M2表型极化的活性组分和成分，部分通过调控miR155和STAT信号通路，影响Arg-1等M2型特征物的表达而抑制巨噬细胞M2表型极化后提高的乳腺癌细胞体外迁移力。 　　[关键词]甘草总黄酮；异甘草素；巨噬细胞；表型极化；作用机制 　　甘草GlycyrrhizaeRadixetRhizoma为豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎。其味甘，性平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的作用[1]。自20世纪60年代以来，人们就发现甘草属植物中的黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、强心、镇静镇痛、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用[2-4]。已报道其黄酮类成分中的异甘草素、异甘草苷、甘草查耳酮A、甘草查耳酮E、甘草素、光甘草定、光甘草素和甘草醇具有抗肿瘤活性，可望开发成低毒抗癌药物。 　　巨噬细胞极化是单核细胞活化后一系列功能状态两个极端，各种微环境信号诱导调节它的分化；极化后的巨噬细胞适应局部环境同时又成为局部环境不可或缺的组分，与各种因子协同作用调节肿瘤发生、生长、侵袭、转移，肿瘤血管和淋巴管生成等过程。根据不同的功能特性及其诱导应答，通常把巨噬细胞分为M1和M2。肿瘤相关巨噬细胞大多是M2型巨噬细胞，促进肿瘤转移、侵袭和免疫逃逸，其数量与多种肿瘤预后呈负相关[5]。尚未有甘草调控肿瘤相关巨噬细胞（M2型）的报道，作者前期已发现甘草总黄酮（TFGR）及其成分异甘草素（ISL）调控M1型巨噬细胞并阐明其部分机制[6]，本文将考察TFGR和ISL对M2型巨噬细胞表型极化的影响及其机制。 　　1材料 　　1.1药物与试剂甘草购自上海养和堂药业公司（批号041028，产地新疆，经上海市食品药品检验所检验为甘草，报告书编；甘草总黄酮由本实验室自制，经超高压液相色谱法分析，含0.3%异甘草素；异甘草素购自上海同田生物技术有限公司，纯度大于98%；小鼠巨噬细胞株RAW264.7，小鼠乳腺癌4T1细胞株购自美国ATCC公司；鼠源IL-4购自Peprotech公司；胎牛血清购自HyClone公司；RPMI-1640培养基干粉购自Gibco公司；噻唑蓝3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；TrizolRNA提取试剂、High-CapacitycDNAReverseTranscriptionKits购自LifeTechnologies公司；RealMasterMixSYBYGreen试剂盒购自罗氏公司；NC膜购自Whatman公司；预染蛋白Marker购自Progema公司；iNOS，Arg-1抗体购自Abcam公司；p-STAT3，p-STAT6，β-actin购自CellSignalingTechnology公司；辣根标记的羊抗兔二抗、辣根标记羊抗鼠二抗购自SantaCruz公司；ECL检测试剂购自GE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；TaqmanMicroRNAReverseTranscriptionKits，TaqmanUniversalMasterMixⅡ购自AppliedBiosystems公司；引物由上海生物工程服务有限公司合成，其他试剂均为分析纯。 　　1.2仪器CO2培养箱（HEPACLASS100，Thermo，美国）；生物安全柜（Deltaseries，Labconco，美国）；低温高速离心机（Centrifuge5810R，Eppendorf，德国）；倒置显微镜（IX71，Olympus，日本）；酶标仪（SpectraMAX190，MD，美国）；恒温微孔板快速振荡器（QB-9006，海门市其林贝尔仪器有限公司）；细胞计数仪（XDS-500C，上海蔡康光学仪器有限公司）；荧光定量PCR仪（7500FastSyst