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猪苓糖肽HPCE指纹图谱分析 　　摘要：采用毛细管电泳法（HPCE）建立猪苓糖肽的指纹图谱，HPCE工作条件为：采用电解质溶液50 mmol/L硼砂缓冲溶液（pH=10.0），毛细管熔融石英毛细管柱（75 μm×75 cm,有效长度为66.5 cm），电压20 kV，温度25 ℃，波长200 nm。猪苓糖肽的HPCE图谱有8个共有峰。该法具有较好的分离效果，可为猪苓糖肽的质量控制提供有效手段。 　　关键词：猪苓糖肽；?AHPCE；?A指纹图谱 　　中图分类号：S567.390.1?ξ南妆晔堵耄?A 　　 　　猪苓为多孔菌科真菌猪苓（Polyporus umbellatus (pers.) Fries）的干燥菌核，具有利水消肿，渗湿的功效。猪苓糖肽［1］是猪苓菌丝体中的一种糖蛋白，能明显提高动物单核―巨噬细胞功能、NK细胞活性、体液免疫与细胞免疫水平，临床上可用于放化疗病人的升白等。HPCE［2］（high??performance capillary electrophoresis）是近年来迅速发展的一种新型分离分析技术，具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，特别适合于蛋白质、核酸、多肽、糖蛋白等生物大分子的分析。?? 　　本实验采用HPCE对猪苓糖肽进行分析，建立了迁移时间―峰高―峰面积的指纹图谱［3］，为猪苓糖肽质量控制建立了基础。?? 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1?σ瞧饔胧约? 　　1.1.1?A仪器?? 　　HP3D全自动毛细管电泳仪，包括DAD检测器、 HP化学工作站。熔融石英毛细管柱（75 μm×75 cm,有效长度为66.5 cm）。?? 　　1.1.2?A试剂?? 　　氢氧化钠、硼砂和磷酸二氢钠均为分析纯。?? 　　1.1.3?A培养基?? 　　蛋白胨2.0%；蔗糖 4.0%；酵母膏0.2%；K??2PO??40.3%；硫酸镁0.15%；维生素b??10.001%； CaCl??2 0.006%； ZnSO??4 0.00004%； MnSO??4 0.00005%； FeSO??40.00001%。?? 　　1.2?ρ?品的制备 　　1.2.1?χ碥呔?丝体的制备 　　10000 L的发酵罐加入7000 L的培养基，25 ℃，100 r/min培养37 h后，板框过滤得到猪苓的菌丝体，80 ℃烘干，打粉机粉碎，得到猪苓菌丝体粉。?? 　　1.2.2?χ碥咛请牡闹票? 　　猪苓菌丝体粉用10倍水量99 ℃提取两遍，4000 r/min离心，上清超滤（超滤膜的分子量是10000），截流液喷雾干燥，得到猪苓糖肽粉。?? 　　1.2.3?Φ缬狙?品制备 　　称取9批猪苓糖肽粉各1.0 g，加20 mL蒸馏水,超声30 min，于4000 r/min离心20 min，取上清液，0.45 μm滤膜过滤，滤液作为供试电泳样品。?? 　　1.3?Φ缬咎跫? 　　背景电解质溶液A为50 mmol/L硼砂缓冲液（分别在pH = 8.5，pH = 10.0，pH =11.2时进样），样品用50 mbar进样8 S,操作电压20 kV，温度25 ℃，DAD全波长扫描。?? 　　背景电解质溶液B为50 mmol/L磷酸盐缓冲液（分别在pH =2.5，pH =4.0时进样），样品用50 mbar进样8 S,操作电压20 kV，温度25 ℃，DAD全波长扫描。?? 　　 　　2 结果与分析 　　 　　2.1??共有峰的标定 　　根据9批样品HPCE图谱出峰时间、峰形和峰高等各项参数进行分析比较，得出8个共有峰（图1），选用保留时间为16.2 min的色谱峰作为参照峰，分别计算9批样品中共有峰的相对迁移时间平均值，猪苓糖肽毛细管电泳指纹图谱中1-8号共有峰相对迁移时间依次为0.571，0.628，0.971，1.00，1.07，1.42，1.45，1.90（表1）。 　　 　　 　　2.2??共有峰的峰高比 　　比较各批样品的色谱图可知，选用迁移时间在16 min左右的色谱峰作为参照较好。（参照峰用s标示）不同的峰高比见表1。?? 　　2.3?ο嗨贫绕兰? 　　通过对9批不同的猪苓糖肽的电泳图谱分析（表2），各批猪苓糖肽样品相对于4号样品的相似度都在0.93以上（表3），表明各批猪苓糖肽样品所含成分基本一致。?? 　　 　　3 分析与讨论 　　 　　3.1?Φ缬咎跫?的优化 　　3.1.1??缓冲液种类对猪苓糖肽电泳图谱的影响 　　将猪苓糖肽在电泳条件50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH = 2.5，pH = 4.0）下不出峰。可能是在低pH条件下，所有溶质都带正电，电渗流很低，因而迁移速度也相应减慢，同时也会造成溶质间荷质比差异