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激光共聚焦显微镜使用和管理 　　摘 要:阐述了LEICA TCS SP5共聚焦显微镜的组成、工作原理、样品制备方法,提出了该激光扫描共聚焦显微镜的日常维护和管理方法。 　　关键词:共聚焦显微镜 使用 管理 　　中图分类号:TN16 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2011)07(c)-0116-01 　　 　　激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)是随着计算机技术和光电技术的飞跃发展,在20世纪80年代后期发展起来的。在生命科学研发中,LSCM技术已经成为生物医学中一个标准的研究工具。目前共聚焦显微镜的功能非常多,好像是一个科研工作站,其应用也大多在生命科学研究领域。围作为大型贵重精密仪器,LSCM的日常使用的管理需要按照严格的规程来实施,LEICA TCS SP5共聚焦显微镜的使用及管理方法如下。 　　 　　1 了解仪器的组成 　　所有上机操作的人员必须经过培训,了解仪器组成、工作原理和操作规范方可上机。 　　1.1 仪器的组成 　　LEICA TCS SP5主要由四部分组成:(1)显微镜光学系统。为倒置显微镜;镜头包括共聚焦专用平场复消色差10×,20×,40×,63(油镜),100×(油镜)镜头;(2)扫描装置;(3)激光光源。本机器包含4个激光器:405nm激光,氩离子激光(457,476,488和514nm),561nm激光,氦氖633nm激光,共四个检测通道;(4)检测系统。整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活进行。由于激光器在工作时散发大量的热,需要风扇降温,突然断电可能烧坏激光器,因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。 　　1.2 工作原理 　　LSCM的工作原理是:照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,激光光源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,在这光路中,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的,不能通过小孔,只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。 　　 　　2 清楚机器操作基本步骤 　　(1)打开稳压电源。 　　(2)依次打开电脑桌右侧电脑显微镜,扫描器、激光电源开关,将激光开关钥匙顺时针旋转90°至“On-1”位置。(各按钮间隔时间15s以上)。 　　(3)打开显微镜电源及荧光电源。 　　(4)启动徕卡共聚焦软件“LAS AF”。 　　(5)选择合适的物镜、视野。 　　(6)“TL/IL”功能键在明视场和荧光之间切换,通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块,进行样品的荧光观察。 　　(7)工具栏下方ConfigurationLaser,根据染料的激发波长,选择所需激光。 　　(8)点击“Aquire”进行光路设置,可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT检测范围、调节PMT的gain或offset。 　　(9)单击“Additional Channels”以显示透射光检测器(“PMT Trans”),选择观察方法(BF、DIC等)。 　　(10)在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择扫描模式(“Acquisition Mode”),默认模式为xyz扫描,是最常用的扫描模式,可用于xy扫描和z轴层切(xyz扫描)。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由x,y,z,t(时间)以及λ(波长)组合而成的多维扫描模式,如xzy,xyt,xyλ,xyzt,xyzλ,xyzλt等。 　　(11)在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中设置扫描参数,包括分辨率、扫描速度、针孔大小、线平均、面平均、累加及放大倍数等。 　　(12)预览图像并优化参数。点击“Live”以设定的扫描参数预览图像,图像将显示在右侧的显示屏上。调节z轴位置找到最适合观察的焦平面,并调节PMT的电压及偏移,或激光输出功率使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。需注意参数对图像质量的正面和负面影响。 　　(13)采集图像并保存。单击“Capture Image”采集图像,注意:从获取第一张图片后就要开始保存,以后每获取一张图片都要保存一次,以免数据丢失。 　　(14)关闭显微镜汞灯电源。若使用过油镜,需用清洁液或无水乙醇清洁镜头。 　　(15)关闭LAS AF 软件,将激光开关钥匙逆时针旋转90°至“On-0”位置,依次关闭扫描器电源、电脑、显微镜电源。 　　(16)风扇停止后(关闭激光开