痰瘀同治方药物血清对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移影响.docVIP

痰瘀同治方药物血清对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移影响 　　摘要：目的 观察痰瘀同治方对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响，探讨其促血管生成作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞模型，大鼠连续5 d灌胃不同剂量的痰瘀同治方（78.0、39.0、19.5 g/kg）制备各剂量药物血清，采用MTT法检测细胞活力来反应其增殖能力，用细胞划痕实验观察给药后细胞迁移能力。结果 与正常组比较，490 nm处吸光度痰瘀同治方高、中剂量组内皮细胞增殖能力明显增强（P0.01），增殖率分别为49.78%、33.92%；内皮细胞迁移能力也有提高，划痕区相对距离明显减少（P0.01），细胞迁移率分别增加11.36%、11.62%。结论 痰瘀同治方对人脐静脉内皮细胞有促进增殖和迁移的作用。 　　关键词：痰瘀同治方；人脐静脉内皮细胞；增殖；迁移 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0050-03 　　血管新生是一个复杂的高度受控的过程，包括内皮细胞的分类、有选择的血管基底膜和周围细胞外基质降解、内皮细胞迁移，而后，新的毛细血管得以生长出来[1]。内皮在心血管疾病的发展过程中起着关键性 　　基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2009ZX09303- 003、2009ZX09301-005-2-6） 　　通讯作者：刘建勋，E-mail：Liujx0324@ 　　的作用，包括疾病发展时缺血后血管的生成与调节。内皮细胞的损伤及功能障碍与冠心病的发生发展有着密切联系，血管内皮细胞大量增殖与迁移是冠心病发病过程中血管新生的关键环节[2]。中医药关于活血化瘀、益气补血等药物的研究为中药促血管新生的研究提供了重要线索。痰瘀同治方由人参、丹参、黄连、川芎等药物组成，具有益气活血、化痰逐瘀功效，其药物血清对内皮细胞有直接保护作用[3-4]。本研究通过观察痰瘀同治方对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和迁移的影响，探讨痰瘀同治方对动脉内膜新生血管的形成和发展的作用。 　　1 实验材料 　　1.1 动物与细胞 　　SD雄性大鼠20只，体质量280～300 g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2006-0009。HUVEC来自健康产妇脐带，北京市海淀区妇幼保健院提供。 　　1.2 药物 　　痰瘀同治方（由丹参、川芎、山楂等中药组成）提取浸膏干粉，中国中医科学院西苑医院实验研究中心药学研究室提供，8.33 g原药材/g；血管内皮生长因子（VEGF）100 ng/L，BioCoatTM MatrigelTM。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　M199培养基，批号M-200-500，Gibco公司；LSGS添加剂，批号S-003-10，Cascade Biologics公司；明胶，Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、小牛血清（FBS）、1∶250胰蛋白酶，Gibco公司；Matrigel基质胶， Becton Dickinson公司。培养箱，银川市金属制品厂；MCO175型CO2培养箱，日本SANYO；超净工作台，北京昌平常常空气净化设备工程公司；TH4-200型倒置相差显微镜，日本Olympus公司；CMS800型微循环生物图像分析系统，美国GOLD Spring公司；IEC CL31R型离心机，美国Termo Scientific公司；SYNERGY4型酶标仪，Biotek公司。 　　2 实验方法 　　2.1 痰瘀同治方药物血清的制备 　　雄性SD大鼠，常规喂养。随机分为药物高、中、低剂量组和正常组。药物高、中、低剂量组按成人剂量的15、10、5倍灌胃，分别相当原药材为78.0、39.0、19.5 g/kg。正常组给予高剂量药方组等体积蒸馏水。每日灌胃2次，连续5 d。末次给药后1.5 h，用3.5%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，打开腹腔，暴露腹主动脉，取血，室温静置，2000 r/min离心10 min，抽取血清，置56 ℃水浴20 min，微孔滤膜过滤除菌，分装后-20 ℃冰箱保存备用。 　　2.2 人脐静脉内皮细胞原代培养 　　参照文献[5]方法。取健康产妇脐带约20 cm，用PBS冲去残血，血管钳夹闭脐带一端，另一端用钝化针头插入，并用血管钳夹闭固定，注入约15 mL 1%Ⅰ型胶原酶，使胶原酶原充满脐带，37 ℃下消化12 min。收集消化液于培养皿中，用PBS充分冲洗脐静脉，消化液与冲洗液1500 r/min离心10 min。弃上清液，加入5 mL培养液（M199培养基添加50×LSGS和100×青链霉素混合液），轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞移至培养瓶中，37 ℃、5%CO2孵箱中培养18 h后弃去培养液， PBS洗3遍，换入