石斛内生菌SH―1 PQQ基因克隆与生物信息学分析.docVIP

石斛内生菌SH―1 PQQ基因克隆与生物信息学分析 　　摘要：从石斛内生菌变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola）SH-1中PCR扩增得到吡咯喹啉醌（PQQ）基因，其大小为5 444 bp，包含了pqqABCDEF 6个基因，并对PQQ基因进行了生物信息学分析，为下一步构建高效基因工程菌，研究其生物合成途径奠定了基础。 　　关键词：PQQ基因；变栖克雷伯菌；生物信息学分析 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）02-0490-03 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.057 　　PQQ，学名为吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone），化学名称为4，5-二氢-4，5-二氧化-1-氢吡咯（2，3f）醌-2，7，9-三羧酸，又名Methaxatin，是继黄素核苷酸和烟酰胺核苷酸之后在细菌脱氢酶中发现的第三种辅基，世界医学界称之为第十四种维生素。从20世纪80年代开始，人们就开始对吡咯喹啉醌（PQQ）的生理生化进行了研究。PQQ作为醌蛋白的辅基，参与呼吸链电子传递，是一种具有多种生理功能的生物活性物质[1，2]。PQQ具有促进机体生长、防治肝损伤、促进神经生长因子生成、调节机体自由基水平（抗氧化）、提高机体免疫力以及增强细菌对毒性和辐射等极端条件的耐受性等功能，是一种独特的生理活性物质[3，4]，是动物生长、发育和繁殖必需的营养因子[5]。目前，能够以PQQ作为辅基的酶，包括有甲醇脱氢酶（MDH）、乙醇脱氢酶（EDH）、醇脱氢酶（ADH）、葡萄糖脱氢酶（GDH）、聚乙烯醇脱氢酶（PVDH）、奎尼酸脱氢酶（QDH）、果糖脱氢酶（FDH）、聚乙二醇脱氢酶（PGDH）、四氢糠醇脱氢酶（TDH）、山梨（糖）醇脱氢酶（SDH）和羽扇烷宁羟化酶（LUH）等[6]。已知能够产生PQQ的微生物仅限于某些革兰氏阴性细菌，目前尚未明确真核生物能否利用PQQ的醌酶，并且动物和植物本身无法合成PQQ，只是在植物、动物包括人体内以及多种食物中含有痕量的PQQ，含量与维生素K、生物素相当[7-9]。研究还发现，动物主要通过饮食途径摄取PQQ[10]。有些细菌如大肠杆菌和沙门氏菌，自身不能合成PQQ，但能产生依赖PQQ的蛋白质（这种蛋白质称为脱辅蛋白），在摄取外源PQQ时能形成有活性的全酶[11]。 　　PQQ不仅是某些微生物体内氧化还原酶的辅助因子，还是一种刺激生长代谢的营养因子。这种刺激主要表现在：①加快菌体的生长速度和生物产量，但不能缩短其迟缓期；②能显著地缩短菌体生长的迟缓期，但对指数期的生长速度和静止期生物产量没有影响[6]。PQQ还能够显著增强微生物对极端环境的适应能力，促进植物生长、发育与繁殖，如缩短植物的花粉萌发时间、促进种子萌发、提高脂肪酶活性和种子呼吸速率。PQQ具有很好的电化学活性和较高的稳定性，已经用于生物电极上[12]，PQQ的电化学研究不仅有助于研发新的拟生态催化系统，还有助于了解醌酶的催化机制。在构建的几种细菌基因文库中分别克隆到了与PQQ合成有关的基因，并经序列分析、转录及表达研究发现，PQQ的生物合成是一个由5～6步酶促反应组成的多步过程，合成过程可能涉4～7个相关基因：醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）[13]和氧化葡萄糖杆菌（Gluconobacter oxydans）[14]中的pqqABCDE、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）[15]中的pqqABCDEF和外链甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）[16]中的pqqABCDEFG，并且这些基因往往是以基因簇的形式存在。 　　最近研究表明，PQQ也可以消除人体自由基，治疗因自由基过多引发的胃肠疾病、心脑血管疾病、癌症等，在抗衰老方面也起着重要的作用[17]。尽管如此，对于吡咯喹啉醌的分布状况、产生机理、结构、功能和生物学性质还有待进一步研究。本研究利用特异性引物扩增并克隆得到PQQ基因，变栖克雷伯菌（K.variicola）的pqq位点的完整核苷酸序列也已经找到，并且构建了PQQ基因结构图谱，对核苷酸序列比对结果和相关生物信息学分析进行了讨论，为下一步构建PQQ高产菌株，研究PQQ生物合成以及进一步推动PQQ在食品、轻工、农业和医药等方面的应用具有重要的实践意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试菌株 　　供试菌株为石斛内生菌变栖克雷伯菌SH-1（专利号：ZL201310383464.0，菌株保藏号：CCTCC M 2013367）[18]。 　　1.2 DNA提取与目的基因的扩增 　　1.2.1 DNA的提取 采用CTA