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碱性磷酸酶特性分析研究 　　摘要：碱性磷酸酶（AKP）是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。本实验由含pET21a-AKP表达质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。本实验通过对纯化之后的AKP进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对AKP活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定AKP的最适温度和pH以及AKP的变性和复性等实验来研究AKP的特性。 　　关键词：碱性磷酸酶（AKP）； 反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶（ EC. 3. 1. 3. 1）， 是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56 Kda。它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3 个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。大肠杆菌碱性磷酸酶被phoA 基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。 　　碱性磷酸酶即AKP来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。AKP广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。 　　AKP能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状DNA两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒DNA的自身环化；蛋白质的去磷酸化。大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将AKP与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。AKP作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。 　　本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。酶活性也 　　称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适pH、温度25℃等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的化学反应的速率来表示，反应速率愈快，就表明酶活力愈高。酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示，实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。AKP活力的测定是以pNPP为底物，采用分光光度计法来测定AKP的活力的。 　　一、材料与方法 　　1.酶促反应的速率曲线的测定： 　　1.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液 　　1.2试剂：测活液（50mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.2mg/mL BSA，10mmol/L pNPP，2mmol/L MgAc2，pH= 8.5）、酶稀释液（50mmol/L Tris-HCl，0.2mg/mL BSA，pH=8.5）、终止液（0.5mol/L Na3PO4，10mmol/L EDTA） 　　1.3仪器：试管；试剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管； 　　1.4实验方法： 　　1.4.1确定AKP的最佳稀释倍数。将酶分别稀释不同倍数，在30℃水浴锅中与测活液反应10min，测溶液在410nm处的吸收峰，取吸光度值为0.7—0.9之间的稀释倍数。 　　1.4.2 AKP特性分析一-酶促反应的速率曲线测定。用已测的倍数稀释酶，与测活液在30°C分别反应0，3，6，9，12，15，18，21，24，30分钟，测溶液在410nm处的吸收值。每个反应测两次，求平均值。以吸光度A410为纵坐标，时间为横坐标绘制时间作用曲线。 　　2.pH对AKP的酶活性的影响： 　　2.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液 　　2.2试剂：测活液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH=7.5，8.5，9.5；50mmol/ L Caps-NaOH，pH=9.5，10.5，11.5） 　　2.3仪器：试管；试剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管； 　　2.4实验方法：30℃条件下，分别在pH为7.5、8.5、9.5的50 mmol/ L Tris-HCl （含2 mmol/ LMgCl2）缓冲液配制的测活液及pH为9.5、10.5、11.5的50 mmol/ L Caps-NaOH （含2 mmol/ L MgCl2）缓冲液配制的测活液，反应10min后，在410nm波长下测定AKP催化pNPP水解的吸光度值。 　　3.温度对AKP的酶活性的影响： 　　3.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液 　　3.2试剂：测活液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH=7.5，8.5，9.5；50mmo