矽肺患者肺灌洗液AM培养上清对人胚肺FB增殖及TGFβ1表达影响.docVIP

矽肺患者肺灌洗液AM培养上清对人胚肺FB增殖及TGFβ1表达影响 　　文章编号：1005-619X（2007）02-0065-04 　　【摘 要】 目的 分析矽肺病人大容量全肺灌洗回收液（Massive Whole-lung Lavage Fluent,WLLF）中提取的AM中TGF-β1表达情况及AM培养上清对FB刺激后FB增殖和TGF-β1表达的情况。方法 矽肺病人的WLLF中获得AM，用无血清1640培养不同时间后，收集培养上清并作用于FB。采用免疫细胞化学法检测AM与FB的TGF-β1的表达情况，结合自动图像分析系统对其结果进行半定量分析；采用MTT比色法、细胞分裂指数法检测FB的增殖情况。结果 ①矽肺病人的AM表达TGF-β1，随时间点的延长，其表达逐渐增强。②各时间点AM培养上清均有促FB增殖的作用，加入TGF-β1的抗体，这种促FB增殖的作用受到抑制。③AM的24小时培养上清有促进FB增殖及转化生长因子-β1表达的作用。结论 ①矽肺病人灌洗的AM表达TGF-β1，其培养上清对FB有促增殖作用，TGF-β1的抗体对此作用??抑制作用，提示TGF-β1在矽肺发生中起重要作用。②矽肺病人的AM培养上清可以诱导FB的TGF-β1表达，提示FB存在TGF-β1的自分泌机制，在矽肺的发病过程中可能起相当的作用。 　　【关键词】 矽肺；肺泡巨噬细胞；成纤维细胞；转化生长因子 　　 　　1 引言 　　矽肺是一种严重影响劳动能力的职业病，病因清楚，但发病机理至今尚未阐明。一般认为， SiO2粉尘颗粒被肺内巨噬细胞吞噬后，巨噬细胞大量死亡崩解或发生功能和生物学行为改变，释放致纤维化因子，如转化生长因子（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、白介素（Iinterleukin 1,IL-1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis growth factor,TNF）、胰岛素生长因子（insulin-like growth factor,IGF）等，增加肺内细胞外基质成分的合成与分泌，导致肺纤维化。其中，TGF-β1可刺激肺FB合成大量胶原，同时，它还可抑制蛋白水解酶的活性，减少细胞外基质的降解，使细胞外基质沉积增多，所以TGF-β1在诸多纤维化疾病的研究中愈来愈受到重视。以往关于TGF-β1的试验都是采用动物标本，与人的生理情况不尽相同。本研究通过矽肺病人大容量全肺灌洗液收集肺泡巨噬细胞，培养不同的时间后获取培养上清，检测AM的TGF-β1表达情况。再用AM培养上清作用于人胚肺FB，检测FB的TGF-β1表达，同时检测成纤维细胞的增殖情况，以期为拓宽矽肺纤维化的防治途径进一步提供试验依据。 　　 　　2 材料与方法 　　2.1 AM取自在国家煤矿安全监察局尘肺病康复中心进行肺灌洗的病人的灌洗回收液,经 4℃2000r/min离心两次，每次15分钟。加入含10％胎牛血清的1640培养液，37℃培养1.5h，使巨噬细胞贴壁，在无菌操作台内，弃去培养液，用PBS洗涤三次去除残余的血清。按分组条件，重新加入无血清的1640培养液，在37℃5％CO2培养箱内培养至相应时间后收取培养上清和小盖片，培养上清经0.22μm滤膜过滤，－70℃保存备用。盖片用PBS漂洗三次，4％多聚甲醛固定10分钟，低温保存，用于免疫细胞化学检测TGF-β1。 　　2.2 方法 　　2.2.1 试验分组 　　AM分组：无血清1640培养3h、6h、12h、18h、24h后收集各时间点培养液；FB分组：①10％血清组（C10）：含10％胎牛血清的1640培养液培养FB；②无血清组（C0）：无血清的1640培养液培养FB；③上清刺激组（F）：AM培养上清作用于FB；④抗体组(A)：TGF-β1抗体与AM培养上清共同作用于FB。 　　2.2.2 试验步骤 运用免疫细胞化学检测TGF-β1； MTT法检测人胚肺FB增殖；细胞分裂指数法检测人胚肺FB的增殖；免疫细胞化学法检测FB细胞TGF-β1表达。 　　2.3 统计学处理 　　采用SPSS 11.0软件进行统计学处理，所得计量资料数值以均数±标准差（x±s）表示，两组均数之间的比较用t检验，三组或三组以上比较用方差分析。P＜0.05为差异有显著性,P＜0.01为差异有极显著性。 　　 　　3 结果 　　3.1 培养不同时间AM细胞的TGF-β1表达情况随培养时间的延长，染色强度出现持续升高的趋势。各时间点积分光密度值之间比较均有统计学差异（表1）。 　　3.2MTT法检测AM的不同时间点培养上清对FB增殖的影响 　　AM的不同时间点培养上清作用于FB后所测OD值与无血清培养组相比有显著性差异,说明其有促进FB增殖的作用,但促进FB增殖的效应不