纳升液相色谱质谱分析方法重现性对尿液多肽组分析结果影响.docVIP

纳升液相色谱质谱分析方法重现性对尿液多肽组分析结果影响 　　摘 要 多肽组学是蛋白质组学技术的延伸和扩展，在医学和生物学研究中的应用日益广泛，但是，多肽组鉴定方法的重现性对实验结果的影响目前尚不清楚。本研究利用纳升液相色谱高分辨质谱对健康人的尿液多肽组进行了7次平行分析，考察图谱数目、图谱利用率、鉴定的肽段数目、蛋白质数目、样品总离子强度和肽段保留时间等指标的变化，以揭示重复实验之间分析结果的可变性和稳定性。7次测定的肽段数目平均值为208，标准偏差为38； 7次结果合并后，得到了归属于114个蛋白质的426个肽段，肽段和蛋白质数目均显著增加； 而35个蛋白质的109个肽段在所有7次实验中均被检出，表明多肽组的单次分析结果既具有一定的随机性，又具有相对的稳定性。增加平行实验次数会扩大多肽组数据集，但测定3次以上后增加幅度减小。相比于肽段，多肽组的结果在蛋白质水平上更为稳定，提示利用蛋白质为多肽组的生物标志物更为稳健。 　　1 引 言 　　多肽组学的概念提出于20世纪初期，多肽组是指体液、组织和细胞等生物体内全部内源性多肽，蛋白质的异常降解产物与多种生理病理过程相关，因此多肽组是生物标记物的重要来源[1～3]，血液，尿液，唾液、脑脊液、汗液、眼泪和胸腔积液等体液的多肽组均已有报道[4～12]。此外，还出现了神经活性多肽[13，14]、细胞[15，16]、组织[17，18]、植物汁液[19]和各?N标记或非标记的定量多肽组学研究[20～22]。 　　多肽组学是蛋白质组学延伸和扩展，将肽段分离后不经过特异性酶切直接进行质谱分析。早期的多肽组研究通常采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDITOF）方法[23]，该方法只能给出分子量信息并且由于电离抑制效应导致检出的肽段数目较少，与液相色谱（LC）MALDI联用和使用串联飞行时间质谱（TOF/TOF）可获得更多的肽段数目和序列信息[24，25]，但改善并不显著。近年来高分辨质谱技术愈发成熟，扫描速度也不断增加，与液相色谱联用显著地提高了分离分析能力，因此，纳升液相色谱电喷雾串联质谱成为多肽组分析的重要方法，不仅可以准确鉴定肽段序列，还能发现阶梯序列肽段以及氧化和磷酸化修饰的肽段。此外，各种蛋白质组学中的定量标记方法也开始应用于多肽组学分析。在蛋白质组学研究中， 考察质谱分析的重现性时发现， 肽段水平的可变性高于蛋白质，高分辨质谱的重现性优于低分辨质谱； 此外，分析结果的重现性还与样本复杂程度相关，技术性重复的最高重现性也只有80%，而最低仅为35%[26]，但分析方法的重现性对多肽组分析结果的影响尚未见文献报道。本研究通过将同一样品连续分析7次，考察数据依赖的扫描方式下方法的重现性对实验结果的影响，实验发现，分析方法的重现性对多肽组的鉴定结果，尤其是对低丰度肽段和蛋白仍有一定影响。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　EksigentnanoLCUltraTM 2D 系统、TripleTOF 5600 plus高分辨质谱仪、Protein Pilot 4.5软件（美国AB SCIE公司）； 真空冷冻干燥机（美国Thermo Savant公司）； C18反相色谱捕集柱（100 μm × 3 cm，3 μm，15 nm， 美国Eksigent公司）； C18反相色谱分析柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 12 nm，美国Eksigent公司）。纳升液相色谱流动相 A为0.1% 甲酸2% 乙腈，流动相 B为0.1% 甲酸98% 乙腈； 所用试剂为质谱纯或优级纯，均购自美国Thermo Fisher公司； 氧化石墨烯磷酸镧纳米磁性复合材料为自行合成[1]。 　　2.2 反相色谱Triple TOF质谱分析 　　多肽的分离和富集如文献[1]所述， 以上步骤7份样品同时操作， 收集上清合并后冷冻干燥。将分离冻干的多肽样品溶解于NanoRPLC流动相 A中， NanoRPLC液相色谱为EksigentnanoLCUltraTM 2D系统（美国AB SCIEX）， 溶解后的样品以2 μL/min的流速上样到C18预柱上（100 μm×3 cm， 3 μm， 15 nm）， 然后保持流速冲洗脱盐10 min。分析柱是C18反相色谱柱（75 μm×15 cm， 3 μm， 12 nm）， 梯度洗脱条件： 0～42 min， 5%～25% B； 42～56 min， 25%～40% B； 56～64 min， 80% B； 64～70 min， 5% B。质谱采用TripleTOF 5600+ 系统（美国AB SCIEX公司）。， 纳升喷雾III离子源， 喷雾电压为2.4 kV， 气帘气压为207 kPa， 雾化气压为34.5 kPa， 加热温度为150℃，