糖尿病肾病大鼠蛋白尿和肾组织WT1表达相关性研究.docVIP

糖尿病肾病大鼠蛋白尿和肾组织WT1表达相关性研究 　　[摘要] 目的 观察WT1在糖尿病肾病大鼠模型中的表达，从而探讨WT1与蛋白尿的相关性及其在蛋白尿发生发展过程中的作用。 方法 56只雄性Wistar大鼠，随机分为对照组和模型组，建立糖尿病肾病大鼠模型，在第1、2、4、8、12周，应用HE染色光镜观察肾小球、肾小管组织结构变化，免疫组织化学技术检测肾组织WT1蛋白的表达，二辛可宁酸（BCA）法测定24 h尿蛋白排泄量，Western bolt法检测大鼠肾皮质中WT1的表达。 结果 随着模型组大鼠蛋白尿排泄量的增加，肾组织病理改变逐渐加重，WT1表达量逐渐增加，模型组大鼠的WT1表达量均高于对照组（P 0.05）。WT1的表达量和24 h尿蛋白排泄量之间为正相关（r = 0.723 52，P 0.01）。 结论 WT1的表达量随着尿蛋白量的增加而逐渐增多，二者呈正相关；WT1有可能作为判定早期肾脏损伤的参考指标。 　　[关键词] 糖尿病肾病；蛋白尿；WT1；足细胞 　　[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（a）-0013-04 　　蛋白尿是糖尿病肾病（DN）主要临床表现，也是引起肾脏损伤的独立危险因素，因此积极探讨蛋白尿的发生机制以及病理改变，对于临床DN的防治具有重大而深远的意义。近年来，足细胞的相关蛋白分子成为研究蛋白尿的发生、发展的热点，而WT1也成为影响足细胞功能的重要因子，对其研究发现可作为判定糖尿病肾病的早期指标。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验模型的制备 　　雄性Wistar大鼠56只，体重200～300 g，适应性饲养1周后，随机将其分为两组，对照组（6只）和模型组（50只）。除对照组，其余所有大鼠均行戊巴比妥钠腹腔麻醉（30 mg/kg）后行右肾切除术，2周后给予腹腔注射链脲佐菌素（STZ，溶于0.1 mol/L枸椽酸缓冲液中，pH=4.5，65 mg/kg）；对照组仅注射相同数量的枸椽酸缓冲液。48 h后从尾静脉采血用微量血糖仪测定血糖，试纸法测定尿糖。连续3 d空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖强阳性视为糖尿病大鼠模型成功。4周后，测定24 h尿蛋白量﹥30 mg为DN成模标准，未成功者剔除。分别于STZ注射成模后第1、2、4、8、12周处死各模型组大鼠6只，各时间点大鼠处死前代谢笼内收集24 h尿液，-20℃保存待测；处死大鼠后用生理盐水灌冼，取左肾留取肾皮质，一部分用于病理切片观察和免疫组化检查；另一部分用于Western blot检测。对照组大鼠于第1、2、4、8、12周收集代谢笼24 h尿液测定蛋白量，12周时处死留取肾皮质分别做上述检测。 　　1.2 仪器与试剂 　　STZ（美国Sigma公司），苯甲基磺酰氟（PMSF，美国Sigma公司），醋酸纤维膜（美国Pall公司），单克隆鼠抗WT1抗体（美国Santa公司），兔抗鼠IgG（美国Santa公司），血糖仪和试纸（美国强生公司），二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒（美国Pierce公司），光学显微镜（日本Olympus公司），组织匀浆机（德国Heidolph公司），Singmal-15K型低温高速离心机（德国EPPENDORF公司），紫外-可见分光光度计（日本岛津公司），BIORAD GS-800图像分析系统（美国BioRad公司），X-光胶片（美国柯达）。 　　1.3 检测项目 　　1.3.1 24 h尿蛋白定量 各组大鼠在处死前收集代谢笼内24 h尿液测定尿蛋白量，取4 mL尿液，2000 r/min离心10 min，去除沉渣并于-20℃保存，采用BCA法检测24 h尿蛋白量。 　　1.3.2 肾脏组织学检查 ①组织学采用光学显微镜观察：脱蜡和水化、苏木素染色、伊红染色、复染、常规脱水、封片、镜检。②新鲜组织经固定，脱水，石蜡包埋进行免疫组化检查，WT1定位。 　　1.3.3 Western blot 将大鼠的肾脏组织剪碎，冰上称取大鼠肾皮质100 mg，加入400 μL（含PMSF）裂解液于匀浆器中进行匀浆，然后置于冰上经匀浆器和裂解仪和匀组织，提取蛋白，Braford法测定蛋白浓度。将组织液与缓冲液一起加热、上样，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后转膜、抗体杂交、显影、洗膜、孵育、曝光、定影后得到蛋白印迹，并用考马斯亮蓝法测定吸光光度值，内参为β-actin，从而确定WT1的含量。 　　1.4 统计学方法 　　采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 大鼠的一般状态