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美味牛肝菌多糖发酵工艺研究 　　摘 要:本文对美味牛肝菌(Boletus edulis)液体发酵生产粗多糖的培养基和发酵条件进行了筛选。在实验范围内,美味牛肝菌发酵生产粗多糖的最适培养基配方为：马铃薯10.0%，蔗糖 2.0%，蛋白胨 0.6%，KH2PO4 0.3%，MgSO4?7H2O 0.2%，CaCO3 0.2%，ZnSO4?7H2O 0.1%。在初始pH 5.0～5.4,振荡转速120 r/min,培养温度25～28 ℃,250 mL三角瓶中装液量40%,加10颗玻璃珠,发酵时间5 d时摇瓶培养粗多糖产量最高，达3.161 g/L。经10 L机械搅拌发酵罐放大动态实验，研究pH值、溶氧、菌丝生物量（湿重）以及粗多糖产量的变化,可知最适发酵时间为96 h。 　　关键词:美味牛肝菌；发酵条件；摇瓶培养；发酵罐 　　 　　美味牛肝菌(Boletus edulis)属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、牛肝菌科(Boletaceae),与高等植物共生的外生菌根真菌,目前尚不能进行人工栽培［1,2］。美味牛肝菌是一种分布甚广的食用菌,含有丰富的蛋白质、脂肪以及人体必需的多种氨基酸、维生素及微量元素,具有调整机体免疫功能、降低血脂、提高人体免疫力以及显著的抗癌作用［3~5］。由于其独特的风味和优良的食疗保健作用,国内外市场的需求不断增加,采集的野生资源不仅受到季节的限制，更无法满足研发其中活性成分的需求。而采集菌种进行菌丝体发酵具有培养周期短、菌丝生长快、易于大规模生产等优点,为保健食品的研发提供基础［6,7］。为此,笔者进行了美味牛肝菌液体发酵生产粗多糖条件的研究,现将结果介绍如下。 　　1 材料与方法 　　1.1供试菌种 　　美味牛肝菌菌株,编号为ACCC50559,由中国农业微生物菌种保藏中心提供。 　　1.2试剂和培养基 　　苯酚试剂:取AR 级苯酚，参照［8］的方法处理。 　　母种培养基:马铃薯?@20.0%，葡萄糖?@2.0%，酵母粉?@0.14%，蛋白胨?@0.06%，KH2PO4?@0.1%，MgSO4?7H2O?@0.05%，ZnSO4?7H2O?@0.01%，pH自然。 　　发酵培养基:马铃薯?@10.0%，蔗糖?@2.0%，蛋白胨?@0.6%，KH2PO40.3%，CaCO3?@0.2%，MgSO4?7H2O?@0.2%，pH自然(5.4)。 　　1.3菌丝培养和粗多糖提取 　　1.3.1菌丝培养 　　美味牛肝菌菌丝经转接活化后接种于装有母种培养基的三角瓶中(250 mL三角瓶装100 mL培养基)，25 ℃，120 r/min,培养3 d后,培养液作为液体菌种，10%的接种量接种于装有发酵培养基的三角瓶中(250 mL三角瓶装100 mL培养基)， 25 ℃,120 r/min,培养5 d，取发酵液用于菌丝胞内胞外粗多糖提取。 　　1.3.2胞外粗多糖的提取工艺流程［10］ 　　取发酵液100 mL→3 500 r／min离心(1 316 g)20 min→收集上清液→浓缩至15 mL→加入3倍体积的95％乙醇→4 ℃沉淀48 h→1 316 g离心20 min→收集粗多糖→复溶→酶法去除蛋白→浓缩至15 mL→加入3倍体积的95％乙醇→4 ℃ 沉淀48 h→1 316 g离心20 min→收集沉淀于60 ℃恒温干燥收集粗多糖 　　1.3.3胞内粗多糖的提取工艺流程［11］ 　　离心获得的牛肝菌菌丝体→烘干→研磨粉碎→称取10 g→加入100 mL水→80 ℃水浴浸提3 h→1 316 g离心20 min→收集上清液→浓缩至15 mL，之后的方法同1.3.2。 　　1.3.4粗多糖的测定 　　采用苯酚-硫酸法［11~13］测定胞内外粗多糖之和作为本文的粗多糖产量。精确称取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg,于100 mL容量瓶中定容,准确吸取0、20、40、60、80、100、120 μL分别置于比色管中,加蒸馏水至2.0 mL,再各加5％的苯酚1.0 mL,摇匀后迅速滴加浓硫酸5.0 mL,摇匀后于25 ℃下显色20 min,于490 nm波长处测定其吸光度,以糖的质量浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线。 　　1.4发酵培养基的优化 　　1.4.1不同碳源的筛选 　　分别以2％的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、D-果糖替代发酵培养基中2％蔗糖进行碳源筛选，其余条件同1.3.1,每个处理6个重复,测定不同碳源对美味牛肝菌粗多糖产量的影响。 　　1.4.2不同氮源的筛选 　　分别以0.6％的蛋白胨、麸皮、酵母粉、牛肉膏、水解乳蛋白为氮源、其它成分同发酵培养基组分，