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突破衍射极限――探索纳米世界超分辨显微技术 　　摘要：介绍了2014年诺贝尔化学奖，并以此为背景围绕着如何突破衍射极限提高分辨率这一核心问题，通过衍射极限产生的原因、突破的途径及新型显微技术发展的历程及特点等几个方面展开阐述，以期更好地认识新型光学显微技术在探索纳米世界时的作用和意义。 　　关键词：诺贝尔化学奖；衍射极限；瑞利判据；超分辨率；荧光显微技术 　　文章编号：1005?C6629（2015）1?C0012?C05 中图分类号：G633.8 文献标识码：B 　　1 引言 　　2014年10月8日，2014年度诺贝尔化学奖揭晓，美国科学家埃里克?白兹格（Eric Betzig）、威廉姆?艾斯科?莫尔纳尔（William E. Moerner）和德国科学家斯特凡?W?赫尔（Stefan W. Hell）三人获奖，以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成就。 　　长期以来，光学显微镜的分辨率被认为是有极限的，它不可能超过二分之一个光波长度，对于可见光波长而言，约200纳米。1873年德国物理学家阿贝（E. Abbe）指出衍射极限是传统光学显微镜存在最大分辨率的物理限制。然而，在荧光分子的帮助下，今年诺贝尔奖化学奖的几位获得者巧妙地绕开了这种限制，并突破了这一极限。他们划时代的贡献将传统光学显微镜技术带进了纳米领域，使光学显微镜步入了纳米时代。 　　根据纳米荧光显微技术，科学家实现了活体细胞中单个分子通路的可视化。他们能够观察到分子是如何在大脑神经细胞之间生成神经突触；还可以追踪帕金森病、阿尔兹海默症和亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积情况等等。然而科学家在最小分子水平上对活体细胞细节进行研究时，却受到了限制。由于今年三位诺奖得主的贡献，我们可以利用突破衍射极限的光学显微镜对纳米世界一探究竟。 　　这次获奖的是两项独立的技术。第一项是Stefan Hell于2000年研制的受激发射损耗（STED）显微技术。此项技术采用了两束激光。一束负责激发荧光分子使其发光，另一束则负责抵消大部分荧光，只留下一块纳米大小体积的荧光区域。用该技术仔细扫描样本，得出的图像分辨率打破了Abbe提出的显微分辨率极限。Eric Betzig和William Moerner分别独立地进行研究，为第二种技术即单分子显微技术打下了基础。这种方法依赖于开关单个分子荧光的可能性。科学家对同一区域进行了多次“绘图”，每次仅仅让很少量的分散分子发光。将这些图像叠加起来产生了密集的纳米尺寸超分辨率图像。2006年，Eric Betzig首次采用了这一技术[1]。 　　今天，超分辨纳米显微技术已被世界广泛采用，新知识源源不断地产生，造福着人类。利用超高分辨率显微镜，可以让科学家们在分子水平上对活体细胞进行研究，如观察活细胞内生物大分子与细胞器微小结构以及细胞功能如何在分子水平上进行表达及编码，对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。 　　本文围绕着如何突破分辨率极限这一核心问题，通过分辨率极限产生的原因、突破的途径及新型显微技术发展的历程及特点等几个方面展开阐述，以期更好地理解新型光学显微技术在探索纳米世界时的作用和意义。 　　2 衍射极限与瑞利判据 　　传统（透镜式、传输光）光学显微镜的有效放大倍率是有限的，它取决于成像的衍射极限。光在传播过程中，遇到障碍物或小孔时，光将偏离直线传播的途径而绕到障碍物后面传播，即光的衍射现象。衍射效应使障碍物后空间的光强重新分布，使得一切几何影界失去了明锐的边缘。衍射极限是指一个理想物点经光学系统成像，由于衍射的限制，系统所成的像不再是理想的几何点像，而是得到形成明暗相间的衍射图样（夫朗和费衍射像）。许多成像光学仪器就是一个低通滤波器，物平面包含从低频到高频的信息，透镜口径限制了高频信息通过，只许一定的低频通过，因此，丢失了高频信息的光束再合成，图像的细节变模糊。这是显微镜分辨率受到限制的根本原因。因为一般光学系统的口径都是圆形，大约有84%的光能量集中在中央亮斑，即爱里斑（Airydisk）（图1a），这样每个物点的像就是一个弥散斑。当两个物点过于靠近，其弥散斑重叠在一起，就可能分辨不出是两个物点的像，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的，即光学系统中存在着一个分辨极限。 　　Abbe用衍射理论预言了分辨率极限的存在[2]，这个分辨极限通常采用瑞利（Rayleigh）提出的判据[3]：当一个爱里斑的中心与另一个爱里斑的第一级暗环重合时，两个爱里斑像就可分辨或恰可分辨，如图1b所示。如果两个爱里斑的中心间距小于爱里斑的半径（图1c），两个爱里斑像就不能分辨。对于显微镜物镜，锥形光束聚焦的焦斑最小可分辨尺度设为CD，则： 　　3 突破衍射极限