草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线构建.docVIP

草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线构建 　　构建草菇冷诱导??Cor3??基因实时荧光定量PCR的标准品和标准曲线。通过培养草菇菌丝，提取总RNA并逆转录为cDNA后进行PCR扩增，电泳后纯化产物，T??A克隆，测序，获得了预期质粒，提取质粒，梯度稀释构建标准曲线，取得了满意结果。为利用实时荧光定量PCR技术研究草菇冷诱导??Cor3??基因的表达奠定了基础。?? 　　草菇； 冷诱导；Cor3??基因； 定量PCR； 质粒标准品； 标准曲线 　　S646.130.1??A 　　 　　草菇营养丰富，味道鲜美，是一种高温型食用菌，生长速度快，从播种到收获一般只需要2周。但是草菇只能在高温条件下生长，即使是在低温条件下保存，菌丝也会发生自溶，子实体会软化直至腐烂，严重制约了草菇生产的 发展。对草菇低温自溶机理的探索研究，将成为解决限制草菇生产及低温贮藏保鲜问题的关键所在。?? 　　实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与以往的定量技术比较，它不仅操作简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好，而且是在封闭体系中完成扩增并进行实时测定，由于扩增后即获得结果，无须后续操作，大大降低了污染的可能性 ［1］。实时荧光定量PCR技术常用的两种模式为SYBR GreenⅠ法和??Taq??Man探针法，本试验采用??Taq??Man探针法，它的工作原理是利用Taq酶的5’→ 3’外切核酸酶活性，在 PCR的扩增体系中加入一个荧光标记探针（5’端标以荧光报告基团，3’端标以荧光猝灭基团），该探针在 PCR过程中不能被延伸，当探针保持完整时，3’端猝灭基团抑制5’端报告基团荧光发射，在 PCR退火期，探针和正反向引物之间的DNA序列特异性结合，延伸期引物在??Taq??酶作用下延伸，当延伸到探针处时，Taq酶发挥5’→ 3’外切核酸酶活性，切断探针，继续延伸，由于5’端荧光报告基团和3’端猝灭基团远离，荧光发射出来，这样模板每复制一次，就有一个荧光信号的释放，荧光强度与扩增的产物量成正比关系，因此可以对扩增产物进行快速检测和定量 ［2］。目前实时荧光定量PCR技术广泛用于不同种类生物的mRNA表达水平研究、转基因成分鉴别、基因突变分析和病原微生物检测等各个领域［3-6］。?? 　　本研究室孙晓红等通过对低温处理草菇的cDNA文库进行筛选，获得了Cor3基因，序列同源比对发现它与s?蚕佘摘?L?哺甙腚装彼崴?解酶有很高的同源性，半定量RT??PCR验证发现Cor3基因在正常情况下有表达，低温处理后表达量增加，推断Cor3基因可能与草菇的低温自溶现象有关［7］。本文构建了草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR的质粒标准品和标准曲线，为利用荧光定量PCR技术研究其在冷诱导过程中的动态表达情况奠定了基础，对于进一步探讨其在草菇低温代谢途径和低温自溶过程中所起的作用有重要意义。?? 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1?Σ牧? 　　草菇V23菌株由上海市农业科学院食用菌研究所上海遗传育种重点实验室保藏；Trizol试剂购自北京赛百胜生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞、PCR产物纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶、ImPromptⅡ反转录酶、RNasin、限制性内切酶??Bst??ZⅠ和pGEM??T Vector Systems购自promega公司；质粒快速提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；Premix Ex Taq??TM 试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；其它试剂均为市售分析纯。 　　1.2?Σ莨骄?丝体总RNA的制备 　　草菇V23接入PDA平板培养基中32 ℃恒温培养5 d后，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，迅速移至-70 ℃冰箱保存备用。试验所用的器具，如组织捣碎棒等全部在0.1％ DEPC水中浸泡24 h，121 ℃灭菌30 min，烘干。总RNA提取步骤按照Trizol试剂的说明书进行，提取的RNA用DEPC处理的双蒸水溶解，-70 ℃冰箱保存备用。?? 　　1.3?Σ莨骄?丝体总RNA的RT??PCR 　　1.3.1??cDNA的合成 　　合成反应总体积为20 μL，包括5×ImpromptⅡ反转录酶buffer 4 μL，40 U/μL RNasin 0.5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L反转录锚定引物3 μL，200 U/μL ImPromptⅡ反转录酶1 μL，3 μL经70 ℃变性的样品RNA，DEPC ddH 2O 7.5 μL。反应条件 25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃