草鱼肠道枯草芽孢杆菌耐药性分析.docVIP

草鱼肠道枯草芽孢杆菌耐药性分析 　　摘要 采用K-B纸片扩散法首次对从草鱼肠道分离出的1株枯草芽胞杆菌进行药物敏感性、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）研究。结果表明：该菌株对磺胺二甲嘧啶和土霉素有较强的耐药性，而对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等其他12种药物高度敏感。这可能是由于前2种抗菌药物长期使用，已对枯草芽孢杆菌无抑制作用；而后12种药物较少在草鱼上使用，故而高度敏感。 　　关键词 草鱼；枯草芽孢杆菌；药物敏感性；耐药性 　　中图分类号 S852.61+6 文献标识码A文章编号 1007-5739（2008）22-0219-02 　　 　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）是一种短杆状、无荚膜能运动的革兰氏阳性细菌，能产生中生芽孢，最适生长条件为：温度37℃、pH值7.0左右，一般为严格好氧。枯草芽孢杆菌的分布非常广泛，土壤、湖泊、海洋、动植物体表及其栖息地皆能发现。枯草芽孢杆菌能产生纤维素酶分解纤维素，将其彻底水解成葡萄糖。 　　草鱼是以植物为食的草食性鱼类，若要消化植物中的纤维素，需消化道中存在纤维素酶，才能顺利的吸收和利用作为自身生命活动的能量。草鱼本身不能分泌纤维素酶[1]，纤维素酶主要来自于真菌和细菌。据报道，许多微生物能够产生2种以上的纤维素素酶[2]。如果草鱼体内存在纤维素酶，可能是外来细菌进入肠道寄生后而产生的。 　　目前，有关枯草芽孢杆菌的研究主要来源于植物，来源于水生动物较少，且大多都是关于其发酵、酶学等方面的研究，未见其耐药性研究的相关报道。随着抗菌药物大量应用于治疗各种水产品的细菌性疾病，不可避免的对鱼体的有益菌群产生有害影响，特别是机体内外相通的消化道[3]。 　　本试验首次对从水生动物体内分离并鉴定的产纤维素酶分解菌进行药物敏感研究，以了解此菌株对各种常用渔用药物的耐药性程度，以减少对鱼体有益菌群的有害影响，为合理用药提供理论基础，并为此菌株在改善水质环境、提高鱼类体质、增强其免疫力和减少渔用药物使用等水产养殖方面的应用提供依据。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1试验菌株。7#枯草芽孢杆菌：由国家微生物农药工程研究中心提供，从草鱼肠道分离并鉴定。 　　1.1.2试验药物。原粉：氟苯尼考（Florfenicol，山东潍坊三江医药化工有限公司），磺胺二甲嘧啶，诺氟沙星（Norfloxacin，华北制药厂，批号050416），土霉素（Oxytetracycline，中国药品生物制品检定所）；药敏纸片：利富平、头孢哌酮、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、呋喃妥因、氧哌嗪青霉素、青霉素、氟哌酸，由上海伊华医学科技有限公司提供（按1997年美国NCCLS药敏试验法规制备）；麦氏比浊管，购自康泰生物科技生物有限公司（批号050220）。 　　1.1.3培养基。①普通牛肉膏蛋白胨的液体培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1 000mL、pH值为7.0，高压蒸汽灭菌后保存备用。固体培养基按上述配方添加琼脂20g，灭菌保存备用。②M-H培养基：此培养基为K-B纸片扩散法专用。牛肉300.0g，酪蛋白酸性水解物17.5g，可溶性淀粉1.5g，琼脂17.0g，加蒸馏水1 000mL制成肉浸汤，加入各成分，调整pH值至7.2，于121℃高压灭菌15min。③羧甲基纤维素钠选择培养基：羧甲基纤维钠15.0g、酵母浸膏1.0g、MgSO4#8226;7H2O 0.5g、KH2PO4 1.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1 000mL。 　　1.2方法 　　1.2.1药物敏感性试验。采用K-B纸片扩散法[4]，按照美国国家临床实验室标准委员会NCCLS2004年版的标准将结果判断为敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。 　　（1）药敏纸片的制备。用打孔机将滤纸打成直径为6mm的圆形纸片，每100片放入小平皿中，外包牛皮纸，121℃灭菌20min后，烘干备用。抗菌药物按表1配制[5]，配好后以无菌方法吸取规定浓度的抗菌素液，每100片纸片加制备液1mL混匀并浸泡1～2h后，放置25℃恒温箱内3～4h即可干燥。干燥后立即装入无菌的小瓶中，加塞贮存于-20℃冰箱的冰冻柜。使用前从冰箱中取出。 　　（2）试验步骤。将37℃培养16～18h的4种斜面活菌用灭菌生理盐水调成菌悬液，通过麦氏比浊管比浊使其达到10×108cfu/mL的菌液后，均匀涂布于M-H培养基平皿，然后贴上14种药敏纸片（直径6mm），恒温37℃培养24h后，观察并记录结果。以上步骤平行测定3次，并取其平均值。 　　（3）常规方法的结果判定。指导临床用药，即抑菌圈直径小于10mm为耐药（R），10~15mm为中度敏感（L），大于15mm为高