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半滑舌鳎gadd45g基因的克隆、功能分析和染色体荧光原位杂交-水生生物专业论文
万方数据
独创声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他人己经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得 (注:如没有其他需要特别声明的,本栏可空〉或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。
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半滑舌鳎 Gadd45g 基因的克隆、功能分析
和染色体荧光原位杂交 摘 要
半滑舌鳎是一种在我国广泛养殖的经济鱼类,本文以山东海阳工厂化养殖的 半滑舌 鳎为 研究对 象 ,利用 多种 分子生 物 学技术 手段 系统研 究 了半滑 舌鳎 Gadd45g 基因的全长 cDNA 克隆,分析其基因序列的进化性,较为系统的研究了 基因在半滑舌鳎组织和性腺发育中的表达,成功将基因定位于半滑舌鳎染色体 上。这些基础性的研究资料将填补半滑舌鳎 Gadd45g 基因研究的空白,为揭示半 滑舌鳎的性别决定机制奠定了基础,对半滑舌鳎性别控制有积极地作用。
1 半滑舌鳎 Gadd45g 基因的克隆和功能分析 本研究根据半滑舌鳎全基因组测序结果,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)
技术和 cDNA 末端快速扩增(RACE)技术,成功的在半滑舌鳎中克隆得到了 3 种 Gadd45g 基因的全长 cDNA 序列。Gadd45g1 和 Gadd45g2 基因全长分别是 1270bp 和 1181bp,都有 480bp 的开放阅读框,分别编码 159 个氨基酸残基的蛋白,而 Gadd45g3 基因全长 1147bp,编码 155 个氨基酸。利用生物分析软件和网站对基 因编码的氨基酸进行比对分析,发现尽管他们均有保守结构域,但 Gadd45g1 基 因和 Gadd45g2 基因相似度高,与硬骨鱼中的 Gadd45g 型基因及高等哺乳动物的
Gadd45g 基因有较近亲缘关系,而 Gadd45g3 基因则与硬骨鱼中的 Gadd45g-like 型基因有较相似。利用荧光实时定量 PCR 技术对半滑舌鳎各组织中的 3 种 Gadd45g 基因的表达进行了分析,发现 Gadd45g1 基因只在雌鱼中表达,且在肝 脏表达最高,其次为性腺;Gadd45g2 基因在雌鱼性腺表达最高,在雌鱼其他组 织及雄鱼的所有组织均微量表达;Gadd45g3 基因在雌雄鱼的脑中表达最高。对 比雌、雄和伪雄鱼的性腺中 3 种基因的表达,发现 Gadd45g1 和 Gadd45g2 基因在 半滑舌鳎雌鱼性腺中表达高,在雄鱼和伪雄鱼中表达低;Gadd45g3 基因在雄鱼 和伪雄鱼的性腺中高表达,在雌鱼性腺中表达低。在半滑舌鳎仔鱼的性腺发育各 时期,对 3 个基因的表达研究发现,Gadd45g1 基因在 50d 即半滑舌鳎性腺即将
分化的 时期 表达相 对 较高, 该基 因可能 是 半滑舌 鳎性 别决定 的 关键基 因; Gadd45g1 和 Gadd45g2 在 95d 后的雌鱼性腺中均有较高表达,暗示他们在卵巢发 育中有重要作用;Gadd45g3 在 20d 雄鱼性腺中表达高,随后降低,它对半滑舌 鳎雄性性别的影响可能早于性腺分化时期,且在精巢和卵巢发育早期有较高表 达。
2 半滑舌鳎 Gadd45g 基因的染色体荧光原位杂交
对上述克隆得到的 3 种 Gadd45g 基因进行 BAC 文库筛选,成功找到含有目的 基因的单一 BAC 克隆。3 个 Gadd45g 基因分别定位在克隆 Bam002C14,Hind029A24 和 Bam027D12 上。利用 BAC-FISH 技术,制备探针并与染色体玻片杂交,成功将 基因定位在半滑舌鳎染色体上,信号可见。其中 Gadd45g1 基因在 W 性染色体上;
Gadd45g2 基因在 Z 性染色体上;Gadd45g3 基因位于常染色体上。
关键词:半滑舌鳎
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