肠道肿瘤组织中C―erbB2基因启动子区CpG岛甲基化状态分析.docVIP

肠道肿瘤组织中C―erbB2基因启动子区CpG岛甲基化状态分析 　　摘要：目的 探讨肠道肿瘤中致癌基因C-erbB2启动子区CpG岛的甲基化状态。方法 收集经病理确诊的40例肠癌患者甲醛固定的肠道肿瘤组织及相应癌旁组织各40份；采用甲基化特异聚合酶链反应（MSP）检测C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果 肠道肿瘤组织中C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化率（52.5%）低于癌旁组织中存在的甲基化率（75.0%），两者之间差异有统计学意义（P0.05）；肿瘤不同分期和有无淋巴结转移组间C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化率差异无统计学意义。结论 所检标本显示肠道肿瘤组织与癌旁组织间C-erbB2基因启动子区CpG岛甲基化率差异有统计学意义，提示C-erbB2低甲基化可能是C-erbB2蛋白高表达和肠癌发生的原因之一。 　　关键词：C-erbB2；启动子区CpG岛甲基化；肠道肿瘤；甲基化特异性聚合酶链反应 　　现代分子生物学认为肿瘤发生、发展的本质是细胞内遗传调控和表观遗传调控的紊乱[1]。表观遗传学的重要研究内容之一就是DNA甲基化。在肿瘤细胞中，异常甲基化最大的特点是全基因组低甲基化和局部性（CpG岛）高甲基化并存[2]，这既是癌症发生的重要原因之一，也是癌症良恶转化的重要标志。目前发现癌基因活化和抑癌基因失活都与基因甲基化异常有关。近年来，国内外对肿瘤抑制基因启动子区CpG岛过度甲基化作了大量研究，已确认其为基因失活的一种重要机制[3]，但是对致癌基因甲基化状态研究甚少。为探讨C-erbB2基因甲基化状态在肠道肿瘤发生、发展过程中的变化规律和意义，明确肠道肿瘤的发生、发展机制及为预后判断提供检测指标，本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）分析，以初步了解肠道肿瘤及其癌旁组织C-erbB2基因CpG岛甲基化的状态。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 2013年～2014年上海市普陀区人民医院行手术治疗的40例肠道肿瘤患者的癌组织及其相应的癌旁组织，其中男20例，女20例，年龄40～92岁。经病理证实癌组织全部为腺癌，癌旁组织取自距肿瘤中心3cm处外观正常的组织。临床分期按UICC（国际抗癌联合会）标准：T1期0例，T2～T3期38例，T4期2例。标本于术中获取，甲醛固定，置-70℃冰箱保存。 　　1.2仪器和试剂 　　1.2.1仪器 ①Universal 16R型台式高速离心机（德国Hettich公司）；②Gene Quant Ⅱ型RNA/DNA Calculator（瑞典pharmacia Biotech公司）；③PTC-150型Mini CyclerTM （美国MJ RESEARC公司）。 　　1.2.2试剂 ①蛋白酶K（德国Merck K GaA公司）；②TE缓冲液（pH8.0）；③平衡酚（华美公司）；④氯仿：异戊醇（24：1）；⑤冷无水乙醇；⑥70%乙醇；⑦亚硫酸氢盐修饰试剂盒CpGenome DNA Modification Kit（CHEMICON公司，Cat NO.S7820）；⑧10mmol/L dNTP，5U/μlTaq酶，25mmol/LMgCl2（上海生工生物工程公司）；⑨Agarose B Low EEO（Bio Basic Inc公司）；⑩Low MW DNA Marker-A（范围25bp～500bp，Bio Basic Inc公司）；?11引物由本实验室自行设计，上海生工生物工程公司合成。序列如下：甲基化特异引物：上游引物（MF）序列为：5-TTTTACGGGGTTTTTTATTGC-3，下游引物（MR）序列为：5-TAATACTCACTACGACTCCGACC-3（产物120bp）；非甲基化特异引物：上游引物（UF）序列为：5-TTTTTATGGGGTTTTTTATTGT-3，下游引物（UR）序列为：5-ATAATACTCACTACAACTCCAACC-3（产物120bp）。野生型引物：上游引物（WF）序列为：5-CCAGACTTGTTGGAATGC-3，下游引物（WR）序列为：5- AAGAGGGCGAGGAGGAG-3（用于监测亚硫酸氢盐修饰效果，产物352bp）。 　　1.3方法 　　1.3.1组织标本前处理 甲醛浸泡1w内的组织块剪碎后于PBS（ pH7.4）中浸泡1h，换新鲜PBS再浸泡24h，最后加TE缓冲液匀浆后转入1.5ml Ep管中。 　　1.3.2基因组DNA抽提 采用本实验室试剂，用蛋白酶K消化-氯仿抽提法抽提组织DNA，以TE缓冲液溶解，并用紫外分光光度仪进行定量。 　　1.3.3 C-erbB2基因启动子甲基化检测 　　1.3.3.1 DNA亚硫酸氢盐修饰 取10μg DNA按修饰试剂盒CpGenome DN