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羟基自由基引起脱氧核糖核酸损伤研究 　　摘 要 以鲱鱼精脱氧核糖核酸（Herring sperm DNA）为研究对象，利用紫外光（UV, 200～275 nm, 66.4 Lx）激发纳米TiO??2发生光催化作用介导产生羟基自由基（Hydroxyl radical, #8226;OH），探讨#8226;OH引发DNA氧化损伤特性。采用凝胶电泳和高效液相色谱（HPLC）分析法跟踪DNA损伤历程；应用电子自旋共振（Electron spin resonance, ESR）及分光光度法跟踪损伤过程氧化物种及H??2O??2相对浓度的变化；运用生物标准样8-羟基脱氧鸟苷（8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine, 8-OHdG）为内标物，通过HPLC分析DNA损伤产物，研究DNA损伤机理。结果表明，较单纯UV辐照或暗光（Dark）催化条件，DNA浓度10 mg/L，TiO??2浓度1.5 g/L、pH 7～8，紫外光激发纳米TiO??2介导产生#8226;OH引发DNA损伤程度最大；DNA损伤为#8226;OH氧化历程，并伴随有深度氧化过程；DNA结构中鸟嘌呤最易氧化损伤，8-OHdG为DNA氧化损伤中间产物及鸟嘌呤氧化损伤的特异产物。 　　关键词 脱氧核糖核酸损伤； 羟基自由基； 光催化； 8-羟基脱氧鸟苷?? 　　 　　 　　1 引 言?? 　　脱氧核糖核酸（DNA）是所有生物的遗传物质基础，能调控生物的发育和生命机能的运作。环境中多种因素如辐射、温度、重金属诱导DNA损伤。生物体中自由基参与许多重要的生命过程，自由基过多会使有机体发生损伤，主要表现在#8226;OH导致DNA的碱基和脱氧核糖发生化学变化，引起碱基改变、破坏或脱落及脱氧核糖分解等。目前对自由基导致DNA损伤的研究主要从延伸辐射产生介导自由基、自由基的种类引发DNA损伤及DNA损伤过程其结构变化几个方面展开探讨，而从光照激发光催化作用介导产生#8226;OH导致DNA损伤机理的研究尚未见报道。?? 　　本研究以鲱鱼精DNA（Herring sperm DNA）为研究对象，利用紫外光（UV, 200～275 nm, 66.4 Lx）激发TiO??2发生光催化反应介导产生#8226;OH，研究#8226;OH与DNA相互作用机理，重点通过凝胶电泳和HPLC检测DNA损伤程度，采用电子自旋共振（Electron spin resonance, ESR）及分光光度法跟踪损伤过程氧化物种及H??2O??2相对浓度的变化，同时以生物标准样8-羟基脱氧鸟苷（8-Hydroxy-2′-deoxyguanosine, ??8-OHdG??）为内标物，探究#8226;OH攻击DNA结构损伤位点，进一步明确#8226;OH引起DNA氧化损伤机理。?? 　　2 实验部分?? 　　2.1 仪器与试剂?? 　　600E-SOLVENT高效液相色谱仪（美国Waters公司）； ESP300E波谱仪（德国Brucker公司）；GE-100凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）。?? 　　10.0 mg/L鲱鱼精DNA水溶液；10.0 mg/L 8-OHdG溶液；0.4 mol/L 5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（??5,5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide, DMPO）溶液??；1.0 g/L辣根过氧化物酶（Peroxidase horseradish, POD）溶液；10.0 g/L N,N-二乙基对苯二胺（N,N-Diethyl-p-phenylenediamine, DPD）溶液；甲醇为色谱级。?? 　　2.2 实验方法?? 　　在圆柱型硬质石英瓶中加入10 mg/L鲱鱼精DNA及1.0 g/L TiO??2，放置暗处搅拌4 h，使DNA在催化剂表面吸附平衡，计时引入紫外光，间时取样分析，以Dark/TiO??2和单纯UV为对照。在相同实验条件下，调节不同底物pH及TiO??2浓度，分析光催化损伤DNA的影响因素。电泳分析：1%正常熔点的琼脂糖凝胶，电压101 V，电流80 mA，电泳时间30 min。琼脂糖凝胶在302 nm利用凝胶成像系统进行分析。HPLC分析：Kromasil C????18??色谱柱（200 mm×4.6 mm, 5 　　??@ m），流动相为甲醇-0.05%醋酸钠（10∶90，??V/V??）溶液，流速0.5 mL/min，检测波长260 nm。以DMPO为自旋捕获剂，捕获自由基生成DMPO-??#8226;OH加合物??，利用ESR分析DNA损伤过程#8226;OH相对浓度变化。利用DPD法分析DNA损伤过程H??2O??2相对浓度变化。间时取样1 mL加入到已装好H??2O??2测定液（30