脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料修复兔下颌骨缺损实验研究.docVIP

脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料修复兔下颌骨缺损实验研究 　　[摘要] 目的 探讨杜仲醇提取物对脂肪干细胞成骨分化的促进作用及脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料应用于颌骨缺损修复的可行性。方法 将48只新西兰大白兔随机分为4组，并制备双侧下颌骨缺损模型。A组植入脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料；B组植入脂肪干细胞复合羟磷灰石材料；C组单植入羟磷灰石材料；D组为空白组。分别于术后2、4、8、12周处死实验动物，制备组织标本，行大体观察、影像学分析、苏木精-伊红（HE）染色、扫描电镜（SEM）检测，并对影像学分析值及成骨情况进行评价，采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。结果 影像学检查及组织学染色显示A组骨缺损处愈合程度、成骨速度及其质量明显优于其他3组。SEM观察可见，A组复合材料与组织相容性好，无炎症刺激反应。统计牙CT分析数据及新生骨面积，A组的成骨情况优于其他3组（P0.05）。结论 杜仲醇提取物有促进脂肪干细胞向成骨细胞转化的作用，脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料也具有明显骨诱导作用，是一种新型复合材料，可望成为临床应用中修复下颌骨缺损的新型材料。 　　[关键词] 骨； 下颌骨缺损； 杜仲醇提取物； 脂肪干细胞； 羟磷灰石 　　[中图分类号] Q 254 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.017 近年来随着组织工程学和细胞生物学的发展，利用种子细胞复合支架材料修复骨缺损成为新的研究方向，以往骨髓间充质干细胞作为种子细胞一直是研究的热点[1-2]，但由于人体骨髓间充质干细胞在骨髓单核细胞中所占比例较少，且随着年龄的增大比例逐年下降，尤其老年人获取数量更少，从而限制了其在临床的应用。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）作为新的种子细胞，由于其有来源丰富、取材方便、对机体组织损伤小、增殖快、能多向分化、获取数量大等众多优点迅速成为新的研 　　究热点[3-4]。大量研究发现中药杜仲能刺激骨髓干细胞向成骨细胞的分化[5-7]，因为ADSCs与骨髓干细胞 　　有相同的表面黏附因子和受体分子，所以有同样的多向分化潜能。本研究将探讨杜仲醇提取物对ADSCs的成骨分化促进作用和以ADSCs为种子细胞复合载杜仲醇提取物支架材料修复颌骨缺损中的作用，为临床治疗下颌骨缺损提供实验基础和理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验动物 　　选择由佳木斯大学动物实验中心提供的健康新西兰大白兔48只为研究对象，体重2.0～3.0 kg，6月龄，雌雄不限。 　　1.2 材料 　　DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶（Gibco公司，美国），胰岛素、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠（Sigma公司，美国），医用纳米级羟磷灰石（上海源叶生物科技有限公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 杜仲醇提取物的制备 2 g盐杜仲（山东省济南市漱玉大药房，1包1 g，生产批号：110316）加入甲醇至15 mL，室温振荡1 h，静置过夜，15 000 r?min-1离心10 min，弃沉淀。甲醇浸上清经真空浓缩，再加水15 mL溶解后得醇提取物。醇提取物均经0.22 Em膜过滤，-20 ℃保存。 　　1.3.2 兔ADSCs的分离和培养 麻醉下取兔两侧腹股沟脂肪组织，置于培养皿中，无菌条件下清除小血管、外包膜和软组织，PBS缓冲液冲洗3次，眼科剪剪碎，用1 g?L-1Ⅰ型胶原酶37 ℃水浴下消化1.5 h至糊状，2 600 r?min-1离心10 min，除去上清和上层悬浮油性脂肪组织，D-HANK S’液洗涤沉淀2次。用含10%胎牛血清DMEM培养基稀释，过滤，离心，将细胞收集到培养瓶中。于37 ℃饱和湿度，体积分数5%CO2中进行培养，细胞融合80%～90%时，用含0.25%胰酶消化，传代培养后进行成骨诱导，茜素红染色进行成骨鉴定。 　　1.3.3 复合材料的制备 将培养第6代的ADSCs经胰蛋白酶消化和离心后与杜仲醇提取物15 mL复合，细胞计数，制成的细胞悬液浓度为每毫升2×107个。而后将羟磷灰石置于培养皿中，细胞悬液反复滴加到支架材料上，保证支架材料完全浸润。同时在37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，使ADSCs更好地进入支架材料的孔隙中。 　　1.3.4 实验分组 将制备成下颌骨缺损模型的48只新西兰大白兔分为4组。A组植入ADSCs复合载杜仲醇提取物支架材料；B组植入ADSCs复合羟磷灰石材料；C组单植入羟磷灰石复合材料；D组为空白组，不植入任何材料。 　　实验动物称重后，20%乌拉坦（5 mL?kg-1）耳缘静脉注射麻醉。常规备皮消毒铺巾，沿下颌骨下缘做平行切口，长度3～4 cm，分层切开