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舌癌单细胞培养建系与癌干细胞相关标志检测 　　[摘要] 目的 以舌癌Tca8113M1细胞系单细胞培养建系为基础，观察Tca8113M1细胞系中舌癌干细胞存在的现象及其相关标志的变化规律。方法 选取Tca8113M1细胞系，以有限稀释法进行体外单细胞培养并建立细胞亚系，在证实其成瘤性的基础上，进一步采用流式细胞术检测癌干细胞相关标志CD44、CD184、细胞外可溶性抗原（ESA）的表 　　达情况，着重观察单个细胞培养形成细胞克隆的形态与时间。结果 以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单个细胞，在96孔板中进行体外培养，获取12个细胞亚系（获取比例为6.25%），均有高成瘤性。癌干细胞相关标志CD44 　　与ESA均为高水平表达，而CD184表达则在12个细胞系之间有差异。在单个细胞培养中，形成完全克隆、部分克隆与旁克隆3种形态，12个细胞亚系均源于单个细胞形成的完全克隆，均可进行连续传代与扩增，而部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡。结论 Tca8113M1细胞系中可能存在癌干细胞，而单细胞培养可形成完全克隆并建立细胞亚系，是进行舌癌干细胞后续研究重要的细胞培养模式。 　　[关键词] 单细胞； 有限稀释法； 舌癌干细胞； 完全克隆 　　[中图分类号] Q 21 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干细胞是癌组织中一小群具有干细胞特性的细胞，具有自我复制与更新的能力，而且增殖与分裂能力极强，少量细胞即可形成体外移植瘤[1]。近年 　　有关肿瘤发生、转移、耐药与复发等诸多难题均从癌干细胞的角度进行研究。这种研究的基础和前提是明确癌干细胞的标志或分离出癌干细胞，以提供研究的靶细胞。目前已发现多种永生性癌细胞系中存在有癌干细胞，Tca8113M1舌癌细胞系同样可能存在有癌干细胞，可以作为舌癌干细胞的研究对象。鉴于癌干细胞独特的自我复制与更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌细胞系为研究对象，采用有限稀释法分离出单个舌癌细胞进行体外培养，利用癌干细胞的自我复制能力进行分裂增殖，形成预期的单细胞克隆，进一步形成细胞亚系，以此证明Tca8113M1 　　舌癌细胞系中存在癌干细胞的可能性，同时检测细胞亚系癌干细胞标志的表达情况，观察不同细胞亚系的生物学特性，并且动态观察单细胞培养中细胞克隆形成的规律，为从Tca8113M1细胞系中分离舌癌干细胞提供前期实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 舌癌细胞系来源 　　人舌癌细胞系Tca8113由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室建系，四川大学华西口腔医院赠送。右江民族医学院肿瘤分子生物学实验室在此基础上建立了转移人舌癌细胞系Tca8113M1[2]。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　胎牛血清（Hyclone公司，美国），RPMI1640培 　　养基（Gibco公司，美国）；PE标记抗人CD44抗体，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人细胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti- 　　gen，ESA）抗体，PE/cy5标记抗人CD184抗体，同 　　型对照抗体分别为大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1与小鼠IgG2aκ4。CO2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪（BD公司，美国），倒置显微镜（Olympus公司，日 　　本）。 　　1.3 体外单细胞培养、建系及细胞克隆生长的动态 　　观察 　　采用有限稀释法进行体外单细胞培养与建系。Tca8113M1细胞经复苏后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化细胞制备细胞悬液，转移至96孔板，采用有限稀释法保证每个孔有1个细胞，在倒置显微镜下观察其生长和增殖情况，待其生长成多个细胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化转移至6孔板扩增培养后，在培养瓶中反复传代建立细胞亚系。此外，在此培养过程中动态观察单个细胞形成细胞克隆的形态与生长情况，观察时点分别为3 d和1、2、3周。 　　1.4 舌癌细胞亚系成瘤性检测 　　建立裸鼠皮下移植瘤模型。体外培养Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌细胞亚系细胞，选取形态良好的生长期细胞，在生长旺盛时接种。具体步骤如下：消化收集舌癌细胞，800 r?min-1离心3～ 　　5 min，弃上清液，计数细胞总量，以含10%胎牛血清的DMEM培养液按每毫升1×107个细胞的密度稀释细胞；消毒裸鼠右腋窝的皮肤，将细胞接种于皮下，以皮下结节直径超过1.0 cm为成瘤标准。共接种裸鼠45只，具体分组如下：1）Tca8113M1舌癌细胞亚系组