δnp63基因对宫颈癌hela细胞侵袭作用的研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

2011 2011 届硕士研究生毕业论文 ΔNp63 基因对宫颈癌 HeLa 细胞侵袭作用的研究 PAGE PAGE 10 ΔNp63 基因对宫颈癌 HeLa 细胞侵袭作用的研究 专业名称：临床检验诊断学,研究生：邹家琼,导师：罗昭逊 摘 要 目的：研究ΔNp63 基因在 HeLa 细胞中的表达；研究抑制ΔNp63 基因表达后 宫颈癌 HeLa 细胞侵袭、转移能力的改变；探讨ΔNp63 基因在 HeLa 细胞侵袭、 转移作用中与 Z0-1 的关系。 方法：1）扩增并提取ΔNp63-shRNA 质粒做序列鉴定，通过脂质体法介导Δ Np63-shRNA 质粒转染宫颈癌 HeLa 细胞，采用 G418 筛选出稳定表达ΔNp63-shRNA 质粒的 HeLa 细胞，采用 Western blot 检测干扰质粒转染前后 HeLa 细胞中ΔNp63 蛋白的表达；2）采用同质粘附实验、异质粘附实验、Transwell 侵袭实验及细 胞划痕实验检测 HeLa 细胞侵袭、迁移能力的改变。3）利用激光共聚焦扫描显微 镜及 Western blot 实验技术检测 HeLa 细胞中ΔNp63 干扰前后ΔNp63 蛋白与 ZO-1 蛋白表达的改变；采用实时荧光定量 PCR 仪检测在ΔNp63 基因干扰前后 HeLa 细胞中ΔNp63 mRNA 与 ZO-1 mRNA 量的变化；探讨ΔNp63 与 ZO-1 在细胞侵 袭、转移中的相互作用及关系。 结果：1）成功扩增、纯化ΔNp63-shRNA 质粒，通过序列检测鉴定证明Δ Np63-shRNA 质粒序列与设计序列相吻合，确定ΔNp63-shRNA 表达质粒在 48h 时 的转染效率为最佳，通过 G418（700μg/ml）筛选 3 周得到稳定表达ΔNp63-shRNA 质粒的 HeLa 细胞，Western blot 实验显示干扰质粒组的ΔNp63 蛋白表达与阴性 质粒组及空白组比较明显降低（p0.05）；2）干扰质粒组同质粘附细胞数高于阴 性质粒组和空白组（p0.05）；干扰质粒组吸光度 A 值低于空白组和阴性质粒组 （p0.05）；干扰质粒组的细胞穿膜数低于空白组和阴性质粒组（p0.05）；划痕 实验结果显示细胞迁移数在 12h 时三组间比较差异无统计学意义（p0.05），而 在 24h 时干扰质粒组与空白组和阴性质粒组比较细胞迁移数出现明显降低，差异 有统计学意义（p0.05）；3）激光共聚焦显微镜扫描显示ΔNp63 蛋白与 ZO-1 蛋 白在 HeLa 细胞中均出现表达，ΔNp63 蛋白主要集中在细胞核区域而 ZO-1 蛋白 则在胞浆中表达，ΔNp63-shRNA 组的荧光表达弱于空白对照组；Western blot 实验结果显示ΔNp63-shRNA 组中ΔNp63 蛋白和 ZO-1 蛋白的表达与空白对照组比 较明显降低；同时，实时荧光定量 PCR 显示ΔNp63-shRNA 组的ΔNp63 的 mRNA 和 ZO-1 的 mRNA 分别与空白对照组比较差异有统计学意义（p0.05），且ΔNp63 mRNA的表达的抑制也降低了 ZO-1 mRNA 的表达。 结论：1）成功扩增、提取了ΔNp63-shRNA 质粒，成功转染ΔNp63-shRNA 质粒进入 HeLa 细胞，并获得稳定表达ΔNp63-shRNA 质粒的 HeLa 细胞株；2）Δ Np63 基因表达的降低具有抑制 HeLa 细胞的侵袭、转移能力的作用；3）在转染 ΔNp63-shRNA 质粒的 HeLa 细胞中ΔNp63 基因 mRNA 的量和蛋白表达受到明显抑 制；4）ΔNp63 基因 mRNA 量和蛋白表达的降低下调了 ZO-1 基因 mRNA 的量和蛋 白的表达，在参与调控 HeLa 细胞的侵袭、转移中ΔNp63 基因可能对 ZO-1 基因 具有调控作用。 关键词：肿瘤；HeLa 细胞；ΔNp63；sh-RNA； 前 言 宫颈癌是妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈不断上升的趋势， 且发病年龄年轻化，在全球女性恶性肿瘤中的发病率仅次于乳腺癌，而在发展中 国家发病率居首位，在确诊时多数肿瘤己发生侵润、转移，严重威胁着妇女的身 心健康。尽快明确宫颈癌的侵袭及转移的发生和调控机制，以指导临床工作，降 低宫颈癌患者的死亡率，已成为迫切解决的问题。 随着分子生物学的发展，肿瘤发生、发展机制的研究已进入到分子层面，在 实验研究中通常对肿瘤相关基因做了癌基因和抑癌基因分类。抑癌基因与癌基因 表达的变化与肿瘤发生发展密切相关,其中p53基因在上皮源性肿瘤中受到广泛 关注，目前学术界认定p53基因是一个抑癌基因 [1-3]。p53基因家族包括p53、p63 和p73三种基因，其中的p63基因和p73基因均具有两个亚型，即反式启动截短亚