ε-聚赖氨酸合成机理及发酵条件研究-食品科学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期 西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西 华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。(保密的论文在解 密后遵守此规定) 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期 西华 西华大学硕士学位论文 摘 要 以实验室筛选高产菌株 Streptomyces griseolus 作为出发菌种发酵生产 ε-聚赖氨酸， 研究其发酵最佳的培养基成分，优化发酵工艺，达到提高 ε-聚赖氨酸产量的目的，扩大 至发酵罐发酵，制定合理的提纯工艺，对其合成产物进行验证，从 GeneBank 中搜索已 知产 ε-聚赖氨酸菌株登陆的编号 AB385841 中获取 pls 片段序列(gene for epsilon-poly-L-lysine synthase)设计合理引物扩增实验室菌株基因组序列，通过测序等分 析手段初步研究。主要的结论如下： 摇瓶发酵方面，试验在优化培养基基础上辅以 D152 树脂原位分离发酵实验，结果 发现当甘油与 D-木糖按照 3:7 混合作为复配碳源，(NH4)2SO4 与酵母粉按照 1:1.25 混合 作为复配氮源时，产量最高为 1.76g/L，相比于优化前的发酵产量、比发酵量和发酵效 率分别提高了 30.1%、18.8%和 17.1%。 原位分离实验还证明 ε-聚赖氨酸添加后的反馈抑制作用并不十分明显，但使用 D152 树脂后，对比空白对照 ε-聚赖氨酸产量提高了 24.8%。证明 D152 树脂消除了一些在发 酵过程中产生的较强的反馈抑制作用物质，对比还原糖的消耗，发现发酵效率提高了 13.38%。 ε-聚赖氨酸带有正电荷，故选用阳离子交换树脂 D152 作为吸附剂进行产物的纯化 回收，制定的回收工艺为：树脂在中性条件下 25℃震荡吸附 30min；洗脱液 HCl 浓度为 0.1mol/L，洗脱条件 150r/min，温度 30℃，时间 60min；使用乙酸乙醚（2:1）沉淀，过 滤后溶解通过 Sephadex G-25 凝胶柱，流速为 4ml/L，后用 ddH2O 洗脱，收集洗脱液冷 冻真空浓缩，即得纯品。该工艺下，树脂吸附量为 101.6g/L，解析率为 91.6%，最终计 算其回收效率为 77.5%，产物纯度可达 94%。 纯化后样品经薄层层析，证实样品水解产物与赖氨酸、ε-聚赖氨酸标准品水解产物 具有相同的 RF 值，确认产物为赖氨酸聚合物，再经核磁共振波谱验证，产物出峰与峰 面积比均与文献一致，确认产物为 ε-聚赖氨酸。 发酵罐阶段以摇瓶发酵为基础实验，采用两阶段控制 pH 法进行发酵过程调控，重 点研究了 pH 值与搅拌速率对发酵体系的作用影响，优化发酵罐条件为 350r/min，30℃， 磷酸盐调节初始发酵 pH5.75，发酵过程 pH 自然下降至 3.75 时用 10%氨水维持 pH 直至 发酵结束，溶氧初始为 100%，待自然下降至 30%后，调节通风比维持溶氧直至发酵结 束。实验所得菌体生物量为 12.6g/L，ε-PL 的产量 2.75g/L，优化前发酵罐产生物量为 7.48g/L，ε-PL 的产量 2.17g/L，而实验室摇瓶发酵的生物量和 ε-PL 的产量仅分为 4.32 g/L 和 1.78 g/L，优化后产量提高了 54.5%。 I 为从基因水平验证实验筛选菌株所与标准对照菌株的同源性，实验设计简单的扩增 基因序列手段，并进行测序对比，对比菌株实验采用 Yoshimitsu Hamano 贡献的标准菌 其 Gene Bank 登陆号为 AB385841，通过设计引物扩增测序后发现实验室筛选菌株该片 段同源性为 42.6%。 II Abstract Laboratory screening of high yield strain Streptomyces with griseolus poly lysine as the starting strain fermentation production of epsilon, study