血管紧张素II对骨髓间充质干细胞定向诱导为角质形成细胞调控作用实验研究.docVIP

血管紧张素II对骨髓间充质干细胞定向诱导为角质形成细胞调控作用实验研究 　　[摘要]目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为角质形成细胞的可能性及在此过程中血管紧张素II（AngII）对其的调控作用。方法：抽取Wistar大鼠的骨髓，经全骨髓法分离、纯化MSCs，鉴定后建立MSCs细胞模型，用成胶质细胞诱导培养基诱导其为角质形成细胞，显微镜下观察其形态学变化。以添加了AngII的成角质形成细胞诱导培养基组与单纯成角质形成细胞诱导培养基组在诱导MSCs 7天、10天后行角蛋白10（CKP10） 免疫组织化学染色及流式细胞仪检测，并进行对比观察分析。结果：培养的MSCs具有成脂、成骨分化的能力。MSCs可以成功诱导为角质形成细胞，添加AngII的诱导组与对照诱导组CKP10免疫组化染色均有阳性表达，但添加AngII组阳性细胞数高于对照组。流式细胞仪检测显示CKP10阳性细胞百分率，AngII组为80.62%，对照组（32.46%），两者相差显著（P0.05）。结论：MSCs可以诱导分化为角质形成细胞，ANGII对MSC的成角质形成细胞分化有显著的促进作用，这一作用可能是AngII促进创面愈合的机制之一。 　　[关键词]骨髓间充质干细胞；角质形成细胞；创面愈合 　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）07-0739-04 　　众所周知，干细胞在创面修复中起到了重要的作用，其为创面愈合提供了各种组织细胞。业已证明，成体骨髓来源的间充质干细胞（MSCs） 具有多向分化潜能，可作为组织工程中多种种子细胞。关于MSCs分化为多种组织细胞的在体或离体实验研究，国内外已多见报道[1-6]。但MSCs体外培养分化为上皮细胞相关报道较少，其过程中各种调控因素尚不清楚。许多实验以及临床现象已经证明，肾素-血管紧张素系统（RAS）对促进创面愈合起了积极重要的作用。为了探讨MSCs是否能体外诱导分化为上皮细胞以及在这一过程中RAS所起的调控作用，笔者以Wistar大鼠为实验对象，体外培养其MSCs，观察 MSCs是否可分化为上皮细胞以及在这一过程中血管紧张素II（ANGII）所起到的调控作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 MSCs的体外培养与鉴定：采用10～12周雄性Wistar大鼠（中山大学实验动物中心提供），大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下分离双下肢，低糖DMEM培养液从双侧胫骨及腓骨冲出骨髓，50目网筛虑过骨渣，离心弃上清液，以含体积分数10%的胎牛血清青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）的DMEM/ F12培养液重悬沉淀，1×109/L密度接种，于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。24h首次半量换液，以后每3 天全量换液一次。按1∶3传代培养，接近融合的MSCs用质量浓度0.25%的胰蛋白酶（美国 Sigma公司）室温消化30s～1min。取第3代MSCs进行实验。取生长良好的第3代BMSCs，以2×104/ml的细胞密度接种于孔板中，分别加入成骨分化及脂向分化诱导液，观察诱导情况。用ALP染色及油红0染色鉴定MSCs多向分化能力。同时用流式细胞仪检测MSCs的CD29、CD45、CD71、CD90的阳性率。 　　1.2 成上皮诱导：取第3代MSCs按上诉浓度接种于孔板中，用成上皮诱导液进行培养，每3天全量换液一次。成上皮诱导液配置为含体积分数10%的胎牛血清青霉素（100U/ml） 和链霉素（100μg/ml）的DMEM/F12培养液中加入0.5nM骨形成蛋白-4（BMP-4） （RD Systems），0.3mM抗坏血酸，3 ng/ml人表皮生长因子。于倒置显微镜下观察细胞形态的变化。 　　1.3 ANG II调控成上皮诱导：取第3代MSCs按上诉浓度接种于孔板中，分别设置对照组与实验组，对照组按上述成上皮诱导方案进行诱导，实验组在原有成上皮诱导液内加入1×10-7mol/L的ANG II。两组细胞均培养于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中，每3天全量换各自诱导液一次。 　　1.4 免疫细胞化学染色：分别在对照组与实验组细胞诱导7天及10天后，PBS洗去培养基，5%多聚甲醛固定，严格按照Maxim生物技术有限公司提供的免疫组化染色试剂盒说明书操作。氨基联苯胺（DAB）显色。角蛋白10（CKP10）多克隆抗体（Maxim）工作浓度1：100。苏木精复染.以非特异血清代替抗作为阴性对照。角蛋白阳性细胞胞浆呈棕黄色。 　　1.5 流式细胞仪检测：分别在对照组与实验组细胞诱导3天及7天后，PBS洗去培养基，0.25%的胰蛋白酶消化后收集细。CKP10多克隆抗体（Maxim）工作浓度l：20，4℃孵育30min。PBS洗涤3次，加