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西方许旺酵母菌产双加氧酶发酵条件研究 　　摘要：将1株西方许旺酵母菌株应用于降解类β-胡萝卜素产生香味物质的体系中，为生物技术制备香精香料提供研究基础，对其液态发酵培养基及发酵条件进行优化，确定纯种液态发酵最佳培养基组分及发酵条件。以西方许旺酵母为试验菌株，采用摇瓶发酵的方式，研究培养基组分（碳源、氮源、无机盐离子）及添加量与发酵培养条件（温度、初始pH值、接种量、摇床转速）对菌种产双加氧酶的情况。结果表明，培养基最优组成为10.00 g/L葡萄糖、10.00 g/L 蛋白胨、5.00 g/L酵母粉、0.20 g/L FeSO4、0.45 g/L MgSO4?7H2O、3.00 g/L NaNO3、0.50 g/L KCl；最佳优化条件为温度27.90 ℃、起始pH值为7.21、转速为160.00 r/min、接种量为5.00%，发酵时间为72.00 h，此时酶活性达到1.23 U/mL，5次中心点重复试验结果稳定可靠；通过响应面分析发现，温度、起始pH值作用极显著，温度和起始pH值交互显著，客观反映了微生物的发酵条件。 　　关键词：西方许旺酵母；双加氧酶；发酵条件；优化 　　中图分类号： TS201.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0124-07 　　类胡萝卜素广泛分布于自然界中，是很多化合物的前体物质，如C13-类胡萝卜素（非萜类化合物），该化合物包括紫罗酮、二氢大马酮等，是构成茶叶、玫瑰、葡萄酒等的主要香味物质[1]。这些化合物香味阈值低，其中很多是强有效的香气化合物，已经引起香精香料行业的极大关注[2]。从植物资源中萃取类胡萝卜素降解的香味物质生产成本高，而采用生物技术制备的香味物质是纯度高的天然化合物[3]。有学者利用泥土中的细菌、丝状真菌降解类胡萝卜素转化为单环、双环的单萜，但实际应用很少，还没有任何一个单萜类的生物转化已经商品化、工业化生产[4-6]。 　　目前学术研究主要采用微生物固态发酵技术裂解（降解）类胡萝卜素，产生香味物质[7]。在广泛的筛选中，发现真菌、酵母菌具有降解类胡萝卜素的潜在能力。在以金银花为主要碳源化学成分的培养基中，有19种具有降解叶黄素的菌株（或者菌属）被分离出来，在这些分离得到的菌种中，有2种在发酵时可产生挥发性化合物[8]。Zorn等研究报道，50多种丝状真菌、酵母菌能有选择性地降解β-胡萝卜素转化为香味化合物，生物转化产物为单萜、倍半萜、三萜、四萜等化合物[9-10]。王树林等从沙棘汁中分离得到1株可降解β-胡萝卜素的菌株，并对培养基配方及培养条件进行优化[11]。麻俊侠等探索适于β-胡萝卜素降解葡萄球菌生长的最佳化学合成培养基配方，试验对培养基中的碳源、氮源、矿物质、各种生长因子等进行了研究，并确定了它们之间的配比，同时对发酵液的粗酶活进行了初步探索[12]。 　　查阅相关文献发现，国内外对微生物定向降解类胡萝卜素产生香味化合物进行了初步研究，没有进行工业化生物降解类胡萝卜素制备香味化合物生产的报道。此外，由于筛选的材料不同，导致筛选的菌株不同，菌株与培养基以及富含类胡萝卜素的原料不同，从而使菌种的发酵条件不同，导致降解类胡萝卜素生成的香味物质种类和含量有差异。 　　试验以笔者所在实验室筛选的西方许旺酵母菌为培养菌株，研究培养基、发酵条件对微生物产酶的影响情况，从而分析微生物菌体代谢能力及菌种的产酶效果。提高菌株产氧化酶（双加氧酶）能力，提高该微生物及其酶降解β-胡萝卜素生成香味成分的含量。试验目的在于提高该菌株产双加氧酶能力，为其后续在西方许旺酵母降解富含类胡萝卜素产品（番茄、枸杞等）生成香味物质的应用中提供研究基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1试剂β-胡萝卜素（分析纯，美国Sigma公司）；β-紫罗兰酮（分析纯，美国Sigma公司）；葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸铵、硫酸亚铁、氯化钠、石油醚、吐温20、碳酸氢钠、乳糖、硼酸、麦芽糖、蔗糖，均为分析纯；酵母粉、琼脂粉、蛋白胨、天冬酰胺、麦芽提取物，均为生物试剂。 　　1.1.2仪器LDZX-75KBS立式蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SPX-160B-2培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；QYC-200摇床（上海福玛实验设备有限公司）；DGX-8053B干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；UV765紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；CF16RXI离心机（深圳市瑞鑫达科教仪器贸易部）；DK-S18水浴锅（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；QL-866点动仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）等。 　　1.1.3培养基平板培养基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨 5.00 g/L