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适用于SSRPCR试验水稻基因组DNA提取方法比较 　　摘要：为了寻找操作简便、耗时短、成本低的适用于简单重复序列－聚合酶链式反应（ＳＳＲ－ＰＣＲ）试验的水稻基因组ＤＮＡ提取方法，试验以３种类型的水稻样品（叶片、米粒、米粉）为材料，比较了十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法、试剂盒法、蔗糖法、碱法４种基因组ＤＮＡ提取方法对水稻基因组ＤＮＡ提取质量的影响。结果表明，ＣＴＡＢ法提取的叶片、米粒和米粉的基因组ＤＮＡ含量最高，其次为试剂盒法提取的叶片、米粉和碱法提取的米粉的基因组ＤＮＡ含量。通过４种方法得到的水稻基因组ＤＮＡ纯度均不高，但不影响后续的ＳＳＲ－ＰＣＲ试验。ＳＳＲ－ＰＣＲ结果表明，ＣＴＡＢ法、试剂盒法和碱法提取的３种样品类型的水稻基因组ＤＮＡ的扩增均表现出了良好的重复性。其中试剂盒法的提取成本最高，ＣＴＡＢ法耗时最长。整体而言，碱法是最适合水稻ＳＳＲ－ＰＣＲ试验的基因组ＤＮＡ提取方法，且以米粉为提取材料时效果最佳。 　　关键词：水稻；基因组ＤＮＡ；提取方法 　　中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ５２３；Ｑ７８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5794-04 　　水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）是世界上三大粮食作物之一，中国的稻田面积占世界稻田面积的２２％［１］。在水稻和其他大多数作物中，以聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术为基础的分子标记分析如简单重复序列（Ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）标记由于其具有多态性好、可靠性高、技术简单、价格便宜和ＤＮＡ模板使用量低等优点，在分子生物学技术中得到了广泛的应用。ＤＮＡ提取是ＳＳＲ－ＰＣＲ分析的前提。在这一研究中，往往要对几十个乃至几百个样品提取的基因组ＤＮＡ进行ＳＳＲ分析。这就需要进行大量的ＤＮＡ提取工作，而常规ＤＮＡ提取过程比较复杂，是分子标记分析效率提高及成本降低的关键性因素［２］。事实上，针对ＳＳＲ的ＰＣＲ技术对ＤＮＡ质量的要求不是很高，运用一些简单快速的方法获得的基因组ＤＮＡ就可以满足其需要。因而发展简便快速提取基因组ＤＮＡ的方法就显得尤为重要。目前，国内外已建立了多种基因组ＤＮＡ的提取方法，这些方法因所研究的对象和目的不同而有一定的差异，主要是十六烷基三甲基溴化铵（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法、碱法和蔗糖法等，并且多数方法是基于叶片的基因组ＤＮＡ提取为前提［３－７］，所以基于种子基因组ＤＮＡ的提取方法也日益受到研究者的重视［８］，但基于米粉的基因组ＤＮＡ提取方法却鲜有报道。试验比较了以３种类型的水稻样品（叶片、米粒、米粉）为材料的４种基因组ＤＮＡ提取方法（ＣＴＡＢ法、试剂盒法、蔗糖法、碱法）提取的基因组ＤＮＡ浓度和质量，并分析了ＳＳＲ－ＰＣＲ检测结果，试图找出操作简便、耗时短、成本低的水稻基因组ＤＮＡ提取方法。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 材料 　　水稻品系为Ｋ４７８、Ｋ４８０、Ｋ４８２，由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供；将试验里进行基因组ＤＮＡ提取的样品类型分为３类：Ａ，正常条件下发芽７　ｄ的水稻幼嫩叶片样品；Ｂ，单株种子样品；Ｃ，１粒去壳的水稻种子经植物球磨仪研磨后所得到的米粉样品。 　　１．２ ＤＮＡ提取方法 　　１．２．４ 方法４ 参考植物基因组　ＤＮＡ提取试剂盒的操作手册里提取与纯化基因组ＤＮＡ的有关方法，将3种样品进行相关处理，得到可以用做ＰＣＲ模板的材料溶液。 　　２ 结果与分析 　　２．１ 核酸蛋白检测仪检测水稻基因组ＤＮＡ纯度与含量 　　２．２ ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增 　　以４种方法提取不同材料类型的３个水稻品系ＤＮＡ为模板，选取２对ＳＳＲ引物ＲＭ３３６和ＲＭ２９７扩增水稻的ＤＮＡ样品，结果见图１、图２。从图１、图２可见，４种方法提取的水稻基因组ＤＮＡ大多数都扩增出了电泳条带，虽然不同样品的质量及浓度明显不同，而且所有样品都存在不同程度的污染现象，但这些因素显然没有对ＰＣＲ扩增造成明显的影响。引物ＲＭ３３６和ＲＭ２９７扩增的带型在某些样品间存在一定差异，能够反映出这些样品的基因型不同，说明４种方法提取的水稻基因组ＤＮＡ完全能满足ＳＳＲ-PCR分析的需要，可用于种子真实性和纯度的快速鉴定。其中ＣＴＡＢ法、碱法和试剂盒法提取不同材料类型的水稻基因组ＤＮＡ扩增结果都得到了较好地重复，说明这３种方法提取的水稻基因组ＤＮＡ用于ＳＳＲ-PCR试验结果稳定；而蔗糖法的扩增成功率则低于其他３种方法，说明蔗糖法提取的水稻基因组ＤＮＡ含量偏低。 　　２．３ ４种ＤＮＡ提取方法的成本分析 　　３ 小结与讨论 　　ＳＳＲ分子标记具有数量丰富、多态性高、结果稳定可靠等优点，因此在作物品种纯度鉴定［１３］、