重组雌激素受体基因酵母细胞检测牛尿液中β―雌二醇残留方法.docVIP

重组雌激素受体基因酵母细胞检测牛尿液中β―雌二醇残留方法 　　摘要：为探索畜禽产品中雌激素残留的检验方法，加强对畜禽生产过程中激素添加的监控，本研究选择了在我国几种常见影响比较大的合成雌激素-β-雌二醇（E2）为研究对象，建立用于测定动物尿液中雌激素的重组基因酵母检测法。结果表明本方法简单、有效，能够作为雌激素残留检测体系的有益补充。 　　关键词：畜禽产品；重组雌激素受体基因酵母细胞；牛尿液；雌激素；β-雌二醇；残留检测 　　中图分类号： S852.23 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0166-02 　　生产中广泛应用的雌激素，可以通过食物链富集作用于人体，导致生殖障碍、出生缺陷、发育异常、代谢紊乱以及某些癌症的发生[1]。世界很多国家计划或已经制定了一些法律法规限制此外类物质的使用，譬如除己烯雌酚等人工合成类雌激素化合物于1980年华沙国际学术讨论会和同年的联合国粮农组织与世界卫生组织联席会议决定全面禁用[2]。就目前而言，对于环境雌激素的研究还处于起步阶段，很多问题有待进一步揭示。随着重组DNA技术、基因表达及酵母分子遗传学研究的进展，越来越多的外源基因在酵母细胞中获得高效表达，因此，酵母作为一个基因工程表达系统受到广泛研究应用[3]。通过本研究希望能够为我国建立快速检测牛生产中添加雌激素情况的监测提供新技术支持、构建我国畜禽安全生产的预警体系。 　　1 测定原理 　　将人类雌激素受体基因（hER cDNA）转化于酵母，使其高效表达，再将雌激素反应原件（ERE）与编码β-半乳糖苷酶的LacZ报告基因相串联，重组于酵母细胞。当牛尿中的雌激素活性物质与酵母中的hER结合后，会通过生物变构效应，经雌激素效应元件（ERE）顺式激活Lac Z （β-半乳糖苷酶） 基因表达，从而使Lac Z的表达量增加。通过测定Lac Z的活性就可以定量反映牛尿中雌激素的含量。 　　2 试验材料 　　2.1 试验样品采集 　　小牛尿液：从扬州大学实验农牧场采集出生10日龄的小牛尿液12份，依次编号分别为112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、125、128。 　　2.2 试验材料 　　C18柱（美国Welch公司）；甲醇（上海振兴化工一厂，分析纯）；丙酮、无水乙醇、浓盐酸氢氧化钠、二氯甲烷（上海焱晨化工实业有限公司，均为分析纯）；琼脂粉（中国医药集团上海化学试剂公司）；酵母基本合成配养基（SD）及无色氨酸、尿嘧啶（-Trp、-Ura）营养补料原料（美国Clontech公司）；β-雌二醇（扬州大学医学院李湘鸣教授提供）。 　　3 试验过程 　　3.1 重组雌激素受体基因细胞酵母培养 　　3.1.1 培养板制作 按照配方配制选择性固体培养平板SD/-trp、-ura （无色氨酸、尿嘧啶），经121 ℃灭菌20 min，取约15 mL倒入消毒培养皿中，冷凝后用保鲜膜密封，4 ℃保存备用。 　　3.1.2 重组雌激素受体基因酵母细胞（W303-1A/hER-ERE-LacZ）接种 在无菌操作台内将W303-1A/hER-ERE-LacZ划线接种于SD/-trp、-ura 平板，置于30 ℃培养箱内培养3～4 d，使其长出3～4 mm的酵母克隆，保鲜膜密封，4 ℃冰箱保存。 　　3.1.3 扩增酵母克隆 取消毒玻璃瓶1只，加入3 mL SD/-trp、-ura 培养液，用接种环从SD/-trp、-ura 培养板挑取酵母克隆置于3 mL SD/-trp、-ura 培养液中，在30 ℃恒温振荡器中培养过夜（约14 h）。 　　3.2 样品预处理 　　用定性滤纸和漏斗将原尿过滤至干净消毒玻璃瓶中。为减少误差，用具塞试管分装过滤牛尿至消毒玻璃瓶中，每样2份，一份取5 mL做加样试验，另一份取5 mL做空白对照。 　　3.3 试剂配制 　　（1） 8 mol/L NaOH （分子量40）：称取NaOH 32 g，用 100 mL 双蒸水充分溶解。（2） 0.1 mg/mL溶菌酶的ONPG：取40 mg ONPG粉末，加入10 mL的Z Buffer，再加入溶菌酶使其终浓度为 0.1 mg/mL，避光充分混匀，分装为2 mL/管，冷冻保存。 　　3.4 尿样加标 　　小牛尿液分别加入试验选择的雌激素物质：乙炔雌二醇。β-雌二醇做加标后在小牛尿液中的终浓度达到0.050 mol/L。空白对照（即尿样空白）加入等量的乙醇；试剂空白用2 mL蒸馏水代替小牛尿液。 　　3.5 C18吸附柱活化 　　用移液器吸取2.5 mL甲醇淋洗C18吸附柱，每次 15 min，共3次，再用双蒸水清洗3次，每次15 min，将活化后的吸附柱放入4 ℃冰箱保存备用。 　　3