金匮肾气丸对耳聋豚鼠血清SODMDA影响.docVIP

金匮肾气丸对耳聋豚鼠血清SODMDA影响 　　摘要　目的：探讨补肾方金匮肾气丸对耳聋豚鼠血清SOD、MDA的影响。方法：30只豚鼠随机分为正常组、模型组、治疗组3组，庆大霉素制作耳聋模型，治疗组给予金匮肾气丸水煎剂灌服，用药10天后，采血分离血清。检测指标：SOD、MDA含量。结果：豚鼠血清中MDA含量，模型组、治疗组均较正常组有显著增加(P0.01)；与模型组比较，治疗组MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P0.01)。血清中SOD活性，模型组、治疗组均比正常组明显下降(P0.01)；治疗组SOD活性较模型组有显著增加，差异具有统计学意义(P0.05)。结论：金匮肾气丸可以降低试验豚鼠血清MDA表达，并能提高SOD活力，有效清除氧自由基，从而对抗庆大霉素对耳的毒性损伤。 　　关键词　金匮肾气丸　耳聋　豚鼠SODMDA 　　 　　金匮肾气丸源自张仲景《金匮要略》，临床应用十分广泛。近年来，有研究表明金匮肾气丸对豚鼠庆大霉素耳蜗毒性有拮抗作用，可使听力明显改善。笔者通过实验方法，研究金匮肾气丸对庆大霉素耳聋模型豚鼠血清中丙二醛(MDA)含量以及过氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，以期进一步探讨其防治耳聋的机理。 　　 　　1　材料与试剂 　　 　　1.1实验动物：选择无耳疾，耳廓反射正常的健康级白色红目豚鼠30只，雌雄各半，体重230～260克，由浙江中医药大学实验动物中心提供。 　　1.2主要的药品和试剂：丙二醛(MDA)测定试剂盒，批号总超氧化物歧化酶(T―SOD)测定试剂盒，批号金匮肾气丸水煎剂。根据《金匮要略》中所载的肾气丸拟方：地黄30g，山药20g，山茱萸15g，牡丹皮、茯苓、泽泻各10g，桂枝、制附子各5g。制成水煎剂，生药含量1.0g／mL。 　　 　　2　实验方法 　　 　　2.1动物分组：将30只豚鼠随机分成3组。即正常组对照组(正常组)、模型组对照组(模型组)、金匮肾气丸治疗组(以下简称治疗组)，每组10只。 　　 　　2.2造模和方法：分述如下。 　　2.2.1模型组：模型对照组组豚鼠按100mg／(kg?d)注射庆大霉素。 　　2.2.2治疗组：金匮肾气丸治疗组豚鼠每日腹腔注射庆大霉素后，立即给予金匮肾气丸水煎剂灌服，给药量为13.5g／kg／d(相当于成人公斤体重用药量的10倍)。 　　2.2.3正常组：正常对照组豚鼠，予2.5ml／(kg?d)剂量，腹腔注射生理盐水后不做其它处理。3组豚鼠在相同环境下饲养10天，10天后即断头处死，采血分离血清备用。 　　 　　2.3SOD和MDA检测：分述如下。 　　2.3.1MDA的检测：采用过氧化脂质降解物中的丙二醛(MDA)与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色底物，在532nm处有最大吸收峰，从而检测其吸光度值，因为底物为硫代巴比妥酸(ThibablturlcAcidTBA)，所以此法称为TBA法。具体步骤如下：先将豚鼠经过离心处理后所取的血清样本，按试剂盒说明组成配制：试剂一：液体6ml×1瓶，室温保存；试剂二：液体6ml×1瓶，用时每瓶加17ml双蒸水混匀；试剂三：粉剂×1支，用时将粉剂加入90℃～100℃的热双蒸水30ml中，(在溶解过程中可适当加热)，充分溶解后用双蒸水补足至30m1再加冰醋酸30ml，混匀，配好的实际避光冷藏；标准品：10nmol／ml四乙氧基丙烷5ml×1瓶。将以上试剂用旋转混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴(或用锅盖煮沸)40min，取出后流水冷却，然后用离心机3500～4000转／分，离心10min。取上清液，‘532nm处，lcm光径，蒸馏水调零，测试各管吸光度值。 　　2.3.2SOD的检测：总过氧化物歧化酶(TSOD)活力的测定，按50管试剂盒组成配制：试剂一：储备液：血清5ml×l瓶；试剂二：血清5ml×1瓶，4℃～10℃保存；试剂三：5ml×1瓶，4℃～10℃保存；试剂四：血清350μl×1支，4℃保存，不可冷冻；试剂五：粉剂×1支，用时加蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4℃冷藏；试剂六：粉剂×1支，用蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后的试剂避光4℃冷藏保存；显色剂的配制：按照试剂五：试剂六：冰醋酸一3：3：2的体积比配成显色剂，4℃冷藏保存。各试剂(除显色剂)按相应比例置于旋转混匀器中混匀，置37℃恒温水浴40min；再加显色剂混匀，室温放置10min，于波长550nm处，光径1cm比色杯。蒸馏水调零，比色。 　　 　　2,4统计学方法：计量资料用均数±标准差(x±s)表示，用SPSSl3.0软件统计包对各组数据进行统计分析。多组间均数比较用方差分析，均以P0.05、P0.01为差异显