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骨髓基质干细胞在兔DBM上增殖作用研究 　　[摘要] 目的 分析骨髓机制干细胞在兔DBM上增殖作用。 方法 2014年3月―2015年7月，以3只大白兔为研究对象，根据Urist方法制备出DBM（同种脱钙骨基质），测定光密度（OD）值，绘制增殖曲线，分析复合培养后最佳修复软骨移植时机。 结果 SEM观察呈现高密度空隙网架结构，平均孔隙率为（60.19±6.1）%；平均孔径大小为（119.42±6.46） μm；兔DBM材料BMSCs体外复合培养后可见大量骨髓基质干细胞粘附，MTT法检测复合培养6d骨髓基质干细胞增殖达到稳定状态。结论 兔脱钙骨基质具有三维网状结构和良好的细胞相容性是一种较好的软骨组织工程支架材料，最适合移植。 　　[关键词] 脱钙骨基质；组织工程；支架材料；骨髓间充质干细胞 　　[中图分类号] R318.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）01（c）-0053-03 　　软骨的再生和修复能力极其有限，一旦损伤很难自行修复，组织工程学位解决这一难题提供了新途径[1]。种子细胞、支架材料等在组织工程中起到核心作用[2]，BMSCs是一种多功能细胞，在特定培养条件下可分化为成软骨、成骨等多种细胞[3]，目前被认为属于最佳种子细胞。为探讨骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质共同培养，2014年3月―2015年7月以3只大白兔为研究对象，观察BMSCs的生长情况及DBM的生物相容性，以兔为研究对象，现报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选择成年新西兰大白兔（新乡医学院实验动物所中心）3只，雌雄不限，体重约12～15 kg。 　　主要试剂包括GIBCO公司提供L-DMEM、胎牛血清，主要仪器包括AMRESCO公司提供MTT、DMSO，美国OlympusIX71提供倒置相差显微镜，以及法国产飞利浦XL30ESEM提供扫描电镜。 　　1.2 DBM的制备 　　实验严格依照《关于善待实验动物的指导性意见》要求。由市场购买家兔新鲜肩胛骨，取其松质骨，制备成圆饼形状，乙醇浸泡30 min，风干后备用。 　　1.3 BMSCs的分离和培养 　　取新西兰大白兔3只经耳缘静脉，戊巴比妥麻醉，双侧髂嵴脱毛。双侧髂嵴穿刺，抽取骨髓，加入L-DMEM培养基，混匀后，培养24 h后换液，观察其生长情况。原代细胞融合达到80%～90%，接种进入传代培养，第3代细胞进行下一步试验。 　　1.4 DBM 结构观察 　　取6块DBM，固定漂洗脱水，保存过夜，干燥，定向粘附于载物台上观察。 　　用扫描电镜观察DBM的表面结构。每个标本随机取10幅照片，计算平均孔径大小（Image J 软件的Measure 功能）和孔隙率（CS6 软件的直方图（histogram）功能）。空隙面积采用像素（Pixel）表示，孔隙率=（整个照片的像素-骨小梁占的像素）÷整个照片的像素[4]。 　　1.5 BMSCs与DBM体外复合培养及扫描电镜观察 　　取DBM 若干块、再取6块24孔培养板，分为2组， BMSCs为A组：各板放置DBM材料，第3代BMSCs接种于24孔培养板的预湿材料上。B组做空白对照试验，每2 d更换液。观察其生长变化。随后分别在第2、4、6、8、12天时加入MTT 100 μL，测定各孔光密度（OD）值，并绘制生长曲线，电子显微下观察细胞粘附、增殖情况。 　　2 结果 　　2.1 DBM的结构观察 　　DBM支架材料肉眼可见呈现白色海绵状，表面多孔，孔隙大小不一，相互连接，布满网状结果，软件测定平均孔隙率为（60.19±6.1）%；平均孔径大小为（119.42±6.46） μm。 　　2.2 倒置相差显微镜及SEM的观察 　　倒置相差显微镜观察可见A组1 h后细胞开始贴壁，48 h开始增殖。DBM周围存在大量细胞，培养时间延长数量逐渐增多。SEM观察，A组培养2 d DBM细胞大量生长，铺满表面，呈长梭形状，培养6 d 细胞明显增多，细胞相互交叉重叠（图1）。B组孔隙相互交通，呈现蜂窝孔隙状结构（图2）。 　　2.3 绘制BMSCs在DBM上的生长曲线绘制 　　分别在第2、4、6、8、10、12天测定OD值，在培养6 d时，增殖稳定，A组在6d达到最高，生长停滞，然后细胞强度下降，见表1。 　　3 讨论 　　BMSCs来源广泛，体外培养时增殖能力强，一直被认为是软骨组织工程有前途的种子细胞。DBM是目前研究的比较热门的一种骨组织工程材料，大量研究结果证实DBM可应用于软骨缺损修复。DBM是同种异体骨通过脱钙、脱脂、处理得到，去掉了矿物质、脂质成分同时保留了骨基质中以骨形态发生蛋白（BMPs）为主的具有诱导软骨形成作用以及胶原[5]。 　　在组织工