骨刺消巴布剂对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡影响.docVIP

骨刺消巴布剂对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡影响 　　摘要：目的 观察骨刺消巴布剂对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡和凋亡调控基因bcl-2、bax的影响，并探讨其作用机理。方法 选用健康日本大耳白兔40只，随机分为骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组、空白对照组、正常组。Videman固定法进行改良制备兔膝关节骨性关节炎模型，骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组外敷相应药物，空白对照组、正常组不做任何处理，给药5周后处死动物，TUNEL法检测软骨细胞凋亡，免疫组化法检测关节软骨中bcl-2、bax的水平。结果 骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组细胞凋亡率明显低于空白对照组（P0.05）；bcl-2在骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组中的表达高于空白对照组（P0.05），bax的表达低于空白对照组（P0.05），骨刺消巴布剂组与奇正消痛贴组比较差异无统计学意义。结论 骨刺消巴布剂可能是通过上调bcl-2的表达、下调bax的表达来抑制兔膝关节骨性关节炎软骨细胞的过度凋亡，这可能是该药治疗骨性关节炎的机制之一。 　　关键词：膝关节骨性关节炎；骨刺消巴布剂；细胞凋亡；bcl-2蛋白；bax蛋白；兔 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.015 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0039-03 　　膝关节骨性关节炎是以膝关节软骨退变及破坏为主要病变特征，多发于老年人的一种慢性退行性关节疾病，其病因病机目前尚未明确，但最终都是由于软骨细胞的过度凋亡，进而导致软骨的破坏。如何减少软骨细胞的过度凋亡，保持软骨细胞增殖与凋亡的平衡，是预防和治疗膝关节骨性关节炎的关键所在[1]。我们通过观察骨刺消巴布剂对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡和凋亡调控基因bcl-2、bax的影响，探讨骨刺消巴布剂治疗和预防膝关节骨性关节炎的作用机理。 　　基金项目：甘肃省中医药科学技术研究课题（GZK-2011-66） 　　1 实验材料 　　1.1 药物 　　骨刺消巴布剂由本院药剂科制备，批号：甘药制字 规格：70 mm×100 mm；奇正消痛贴，奇正藏药集团生产，批号110928，规格：90 mm×120 mm。 　　1.2 动物 　　清洁级日本大耳白兔40只，由兰州大学医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK（甘）2009-0004，分笼饲养，自由饮水，饲料为该中心提供的标准全价饲料。动物房温度（25±3）℃，相对湿度（60±5）%，光暗周期24 h，为正常昼夜节律。 　　1.3 试剂与仪器 　　bc1-2、bax鼠抗人单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DBA显色试剂盒试剂盒均购于武汉博士德公司。德国Leica EG1160型包埋机，德国Leica RM2126型轮转切片机，显微镜日产Olympus BX50型。 　　2 实验方法 　　2.1 分组与造模 　　40只大耳白兔，采用随机数字表法分为骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组、空白对照组、正常组，每组10只。除正常组外，其余3组均采用经典的Videman固定法进行改良制备兔膝关节骨性关节炎模型[2]：于日本大耳白兔左后肢固定区域包裹棉垫，左下肢外侧安置小铝板（接触皮肤侧垫脱脂棉，长度同管型石膏），再以管型石膏固定（长度从股骨上端至踝关节上1 cm），待石膏定型后，在兔左后肢膝关节前方做2 cm×4 cm开窗处理，待石膏干硬后放回兔笼，单笼喂养，同时用废硬胶片做成“伊丽莎白圈”，反套在兔颈部固定，避免兔撕咬石膏。 　　造模8周后，处死动物，取左膝关节标本，肉眼观察可见关节囊明显增厚，关节液黄色浑浊，量较多，关节软骨呈灰黄色，软骨表面不光滑，局部出现溃疡，关节边缘有骨赘增生，光镜下观察浅表区可见粗糙或有炎性肿胀，产生裂隙，深达辐射区，深层细胞数目异常，表现为细胞数目减少或簇聚，即可判定兔膝关节骨性关节炎模型成功。 　　2.2 给药与取材 　　待造模成功后，立即给予药物干预。骨刺消巴布剂组外敷骨刺消巴布剂，3 d更换1次；奇正消痛贴组外敷奇正消痛贴， 3 d更换1次；空白对照组、正常组不予任何处理。所有动物于给药5周末取材，空气栓塞法处死动物，解剖左膝关节，用咬骨钳、手术刀取股骨髁部，保留软骨组织，放入4%多聚甲醛固定。将标本修剪成3 mm×3 mm×3 mm的组织块，EDTA脱钙8周后石蜡包埋，连续切片，厚度为3 ?m。 　　2.3 检测方法 　　2.3.1 细胞凋亡指数测定 将石蜡切片行TUNEL染色。石蜡切片常规脱蜡水化，蛋白酶K（20 mg/L）室温水解10 min，2%H2O2室温反应5 min，PBS漂洗，TdT酶缓冲液室温孵育5 min，TdT酶反应液湿盒内37 ℃