应用ISSR与REMAP分析吉生羊草体细胞无性系变异.docVIP

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应用ISSR与REMAP分析吉生羊草体细胞无性系变异

应用ISSR与REMAP分析吉生羊草体细胞无性系变异   摘 要:以吉生羊草成熟种子为试验材料,应用ISSR和REMAP进行体细胞无性系变异分析。结果表明:愈伤组织诱导培养基有利于羊草愈伤组织的形成,愈伤组织分化率达80%以上,移栽成活率为85%以上。以ISSR和REMAP实验数据为基础,分别计算18株再生植株及亲本对照之间的遗传相似性系数,表明不同植株彼此间基于ISSR的遗传相似性系数范围为0.931~1.000,平均为0.974。基于REMAP分析,所有分析样本彼此间的遗传相似性系数范围为0.976~1.000,平均为0.996。   关键词:ISSR;REMAP;羊草;体细胞变异   中图分类号:S54 文献标识码:A DOI:10.11974/nyyjs.20160132006   1 材料和方法   1.1 材料   吉生羊草(Leymus chinensis)成熟种子,采自吉林省乾安县。   1.2 方法   1.2.1 培养基   诱导培养基:MS+300 mg L-1酸水解酪蛋白+4.0 mg L-12,4-D+3.0%蔗糖+0.7%琼脂;继代培养基:酸水解酪蛋白+2.0 mg L-12,4-D+3.0%蔗糖+0.7%琼脂;再生苗分化培养基:MS+300 mg L-1酸水解酪蛋白+1.0mg L-12,4-D+0.3 mg L-16-BA+3.0%蔗糖+0.7%琼脂;生根培养基:1/2 MS+1.0mg L-12,4-D+0.1 mg L-1NAA+1%蔗糖+0.7%琼脂(所有培养基pH 5.8)。   1.2.2 愈伤组织诱导、继代培养及再生苗分化   将吉生羊草种子去除颖片,用水浸泡约10h后,无菌蒸馏水清洗1次。将种子用70%乙醇表面消毒1分钟,用0.1%的氯化汞溶液浸泡12min。最后将种子用无菌水冲洗5次,接种在愈伤组织诱导培养基上,置于25±1℃条件下暗培养5周后,将诱导出的愈伤组织转接到继代培养基上进行继代培养5个月后,将胚性愈伤组织转接到再生苗分化培养基上培养,获得再生植株。然后,将高于3厘米以上的再生苗转接进行生根壮苗培养。选取根系良好的健壮再生苗,用自来水冲洗、彻底去掉培养基,移栽至无菌土和蛭石(2:1)的混合基质中,于培养室中湿润条件下培养驯化3周后移栽至大田。   1.2.3 基因组DNA的提取   肉眼观察,吉生羊草再生植株与对照幼苗表型相同。以愈伤组织诱导培养基上一粒吉生羊草种子长出的纤细幼苗为对照,从来源于该粒种子愈伤组织分化的200株再生植株中,随机选取18株用于ISSR和REMAP分析。   1.2.4 DNA提取方法   分别采集再生植株和用于对照实验幼苗的幼嫩叶片,提取基因组总DNA,用改良的CTAB法[1] 。   1.3 ISSR分析   1.3.1 ISSR引物筛选   利用一套ISSR引物(共52个引物)检测吉生羊草再生植株基因组变异,分别随机从吉生羊草再生植株DNA样本中选取3个样本作模板,各自进行2个独立重复PCR扩增实验。根据PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果,分别从这52个引物中选取重复性好、条带清晰、分布均匀的引物进行PCR扩增,进一步筛选出分别适合吉生羊草的ISSR扩增引物,同时记录条带的分布规律。   1.3.2 ISSR PCR扩增反应及产物检测   利用所筛选出的引物,分别对18株实验材料和对照幼苗的2个独立提取批次DNA样本进行ISSR PCR扩增反应。将ISSR PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中进行电泳后,再经溴化乙锭染色,用紫外扫胶仪进行检测、照相。   1.4 REMAP分析   1.4.1 REMAP引物筛选   分别以上述52个ISSR引物作为前引物,利用对应于BARE-1a (accession Z17327) LTR369-393 核苷酸序列为后引物(该序列5′ 端含有一个EcoRⅠ酶切位点)[2],作为REMAP分析的引物组合。针对每一引物组合,分别随机从吉生羊草再生植株DNA样本中选取3个样本作模板,各自进行2个独立重复PCR扩增实验。根据PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果,分别从这52个引物组合中选取重复性好、条带清晰、分布均匀的引物进行PCR扩增,进一步筛选出分别适合吉生羊草的REMAP扩增引物组合,同时记录条带的分布规律。   1.4.2 REMAP PCR扩增反应及产物检测   利用所筛选出的引物组合,分别对18株实验材料和对照幼苗的2个独立提取批次DNA样本进行REMAP PCR扩增反应。产物检测分析同ISSR。   1.5 数据分析   仅对与引物组合筛选时结果都一致(2次独立的实验)的长度为200~2000bp清晰条带进行统计。对于每一材料在同一位点

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