动物源大肠杆菌耐药基因与HPI毒力基因的检测及相关性分析-营养与食品卫生学专业论文.docxVIP

摘 要 大肠杆菌（Escherichia coli）是一种重要的能引起食源性疾病的人畜共患病原菌， 随着抗菌药物的滥用,大肠杆菌耐药性情况日益严重，而细菌的耐药性可通过多种途 径进行传播，引起交叉耐药，严重威胁着人类的健康。耶尔森菌强毒力岛(high pathogenicity island, HPI)通过夺取宿主中的铁元素来增强细菌在宿主体内存活的机 率，进而加重对机体患病的感染能力，毒力岛的发现和研究，对深入了解细菌性疾 病的发生、发展过程以及对疾病的预防控制都有着深远影响。 以大肠杆菌耐药基因和 HPI 标志性基因为研究对象，设计特异性引物，采用 PCR 技术对两类基因进行特异性扩增，通过反应条件和反应体系的优化，建立大肠杆菌 ESBLs 耐药基因（TEM、SHV）和 HPI 毒力基因（irp1、irp2、fyuA）的双重 PCR 检测方法，并对大肠杆菌中耐药基因和 HPI 毒力基因之间的相关性进行了分析。 具体研究内容和结果如下： 1、动物源大肠杆菌分离株耐药表型的检测 采用 NCCLS 推荐的 K-B 法来检测大肠杆菌分离株（猪源 25 株、鸡源 12 株） 对 20 种抗菌药物的耐药性，以大肠杆菌 ATCC 25922 为药敏质控菌，记录并分析实 验结果。 猪源大肠杆菌分离株对于常见的抗菌药物阿莫西林（24/25，96%）、苯唑西林 （23/25，92%）、氨苄西林（22/25，88%）、羧苄西林（21/25，84%）、阿莫西林/棒 酸（21/25，84%）、氯霉素（23/25、92%）表现出很强的耐药性（≥80%）。 鸡源大肠杆菌分离株对于兽医临床中常见的抗菌药物苯唑西林（12/12，100%）、 氨苄西林（11/12，91.7%）、羧苄西林（11/12，91.7%）、阿莫西林（9/12，81.8%）、 阿莫西林/棒酸（9/12，81.8%）表现出很强的耐药性（≥80%）。 其次猪鸡源大肠杆菌对链霉素（18/25，72%、7/12，63.6%）、强力霉素（19/25， 76%、6/11，54.5%）、复方新诺明（14/25，56 %、7/11，63.6%）、诺氟沙星（13/25， 52%、7/11，63.6%）表现出较强的耐药性（50%～80%）。大肠杆菌分离株呈现出多 重耐药，其中对 8～14 种抗菌药物具有多重耐药性的菌株占总分离株 73.0%（27/37）。 该结果对于大肠杆菌分离株中的耐药性做了一个初步的检测分析，为后续基因型试 验提供基础数据。 2、动物源大肠杆菌分离株耐药基因和HPI毒力岛基因的PCR检测 以大肠杆??耐药基因与HPI毒力岛基因作为研究切入点，根据GenBank中已发表 的大肠杆菌标志性基因序列，分别设计合成了大肠杆菌耐药基因TEM、SHV、OXA、 I cmlA、floR、sul-I、sul-II、tetA、tetB、aac(3)-II、aph(3’)-II和毒力岛irp1、irp2、fyuA 等14对特异性引物，提取大肠杆菌DNA作为模板，对大肠杆菌耐药基因和HPI毒力 岛基因进行PCR检测，并对PCR扩增反应条件进行优化。结果表明，大肠杆菌耐药 基因和HPI毒力岛基因引物TEM、SHV、OXA、cmlA、floR、sul-I、sul-II、tetA、tetB、 aac(3)-II、aph(3’)-II、irp1、irp2和fyuA能扩增出目的片段，大小分别是118、132、190、 467、601、925、179、344、388、412、232、799、414、948bp。 通过优化后的 PCR 反应条件和反应体系对所有大肠杆菌分离株的耐药基因和 HPI 毒力基因进行了检测，为建立双重 PCR 同时检测以上两类基因提供数据和理论 基础。 3、动物源大肠杆菌ESBLS耐药基因和HPI毒力基因双重PCR检测及相关性分析 在单重PCR反应条件和反应体系优化的基础上，对双重PCR反应条件和反应体 系中的引物浓度和Tm值进行优化。检测结果显示，检出irp1+TEM、irp1+SHV、 irp2+TEM、irp2+SHV、fyuA+TEM、fyuA+SHV基因的阳性率分别为13.5 %、13.5 %、 21.6 %、21.6 %、16.2 %、16.2 %。在大肠杆菌中扩增出118、132、799、414、948 bp的特异性目的条带，而甲型副伤寒沙门氏菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌中则 不能扩增出。灵敏度试验表明，该反应体系的检测灵敏度为1.5×103 CFU/mL。irp2缺 失株试验表明，irp2中仍能检测出TEM、SHV、sul II、aac(3)-II、cmlA、floR基因。 大肠杆菌中ESBLs耐药基因和HPI基因通过双重PCR方法均能特异检测出，缺失株试 验证实两类基因