加利福尼亚兔与新西兰兔UCP1 基因第5外显子多态性与生物信息学研究.docVIP

加利福尼亚兔与新西兰兔UCP1 基因第5外显子多态性与生物信息学研究 　　摘要：本试验以加利福尼亚兔和新西兰兔为研究对象，分别用磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒提取新西兰兔和加利福尼亚兔的DNA，通过构建DNA池，扩增UCP1基因的第5外显子及第4内含子部分序列。扩增产物进行双向测序，利用DNAStar和BLAST分析测序结果。结果发现：在加利福尼亚兔中没有发现SNP位点，在新西兰兔中有4个多态性位点，分别为G743T、A744G、C819A和G849T，其中G743T为同义突变，A744G为错义突变，导致编码的苏氨酸（Thr）变为丙氨酸（Ala）；C819A、G849T突变位点位于内含子区。多态位点的出现对UCP1基因的RNA二级结构产生的影响表现在其最小自由能由-1.93 MJ/mol变为-1.932 MJ/mol，同时SNPs位点对UCP1基因蛋白结构也有一定影响。 　　关键词：UCPl基因；新西兰兔；加利福尼亚兔；SNPs；RNA二级结构 　　中图分类号：S829.12 文献标志码：A 文章编号：1002―1302（2016）01―0041―03 　　解偶联蛋白（uneouplingprotein，UCPs）是褐色脂肪细胞线粒体内膜上存在的一种质子转运蛋白，它存在于动物的各组织中，在能量平衡、维持体温、机体产热和代谢等方面都起着巨大的作用。比如，它激活后可以产生质子电化学梯度降低，使呼吸链与ATP（三磷酸腺苷）合成过程解耦联，使能量以热的形式释放；UCP1基因参与机体能量代谢，对机体能量平衡涉及的食物转化效率、静止代谢率和体重肥胖等性状具有明显的效应，对肌肉生长和品质的改良作用重大。目前，这个家族的5种蛋白质在鱼、禽类、哺乳动物甚至在人类的不同组织线粒体的内膜上都已发现。其中，UCP1是最早发现的成员。 　　UCP1是褐色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）中表达的标记基因，它具有解离氧化磷酸化耦联功能，如机体通过在线粒体中产生能量，三羧酸循环产生的还原当量通过电子将能量释放，使H+从线粒体基质转移至内膜面，形成1个跨线粒体内膜的质子电化学梯度，当线粒体的ATP合酶将H+从内膜面顺梯度运回至基质面时，其能量可推动二磷酸腺苷与磷酸结合，促使生成ATP。UCP1基因的表达增加可能是受到去甲肾上腺素促进，使其与G偶联蛋白相关的环磷酸腺苷合成，后者又可使蛋白激酶激活，蛋白激酶作用的靶蛋白包括激素敏感性脂肪酶，这种酶一旦被磷酸化激活就可以抑制三酰甘油的贮存，使脂肪分解，非脂化脂肪酸增加，促进产热作用。此外，UCP1表达增加还有可能受肾上腺素和甲状腺素等的刺激，从而增加棕色脂肪组织所消耗脂肪酸的活性，因此UCPl被认为是2型糖尿病和抵抗肥胖的重要基因。 　　Clark等发现，UCP1基因的表达水平对羔羊出生后的成活率起着重大作用。Bassett等发现，UCP1基因的表达对初生羔羊BAT的含量影响重大。然而对兔线粒体中UCP1基因方面的研究很少，本试验以加利福尼亚兔和新西兰兔构建其DNA池，对UCP1基因第5外显子及第4内含子部分序列进行扩增，BLAST分析其测序结果筛选多态位点，由DNAStar软件进行序列拼接、校正，并预测其对RNA结构影响和等位基因频率估算。 　　1材料与方法 　　1.1样品的来源 　　从贵州贵阳白云牛场大林农牧专业合作社种兔场和贵州贵阳修文盛鑫兔业开发有限公司种兔场采取加利福尼亚兔的组织样48个和新西兰兔组织样48个，将采取的样品放在已编好序号的自封袋中于-20℃冰箱中保存。 　　1.2构建DNA池和引物设计、合成 　　利用磁珠法动物基因组（组织）DNA抽提试剂盒提取DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提的DNA，取5μL构建DNA池。以兔UCPl基因（其GenBank登录号为：NC_013683.1）DNA序列利用Primer-BLAST设计1对引物来扩增UCPl基因第5外显子和第4内含子的部分序列，将所设计的引物送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。物序列为F：GAGGTAAGTCCATCCCCACG，R：ACTCTTCTA-ACGATGTAGTGTC；退火温度为59℃；目的片段大小为809 bp。 　　1.3 DNA的扩增和序列的分析 　　反应体系为25μL：2×Taq PCR Master Mix试剂12.5μL，基因组DNA 2.5μL，三蒸水7μL，上、下游引物10 pmol/μL各1.5μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用凝胶成像系统观察结果，最后拍照保存。 　　将扩增的产物送往立菲生物技术