试验八细菌的分离培养.DOC

实验八 细菌的分离培养 【实验目的】 1．掌握细菌需氧和二氧化碳培养方法。 2．掌握平板划线法斜面、液体和半固体培养基等各种接种方法。 3．熟悉常用的厌氧培养技术。 4．熟悉接种细菌用具、接种细菌的环境要求和无菌操作要领。 【实验材料】 1．器材 口玻璃干燥器 2．试剂 重碳酸钠盐酸 【实验方法】 1．需氧培养法 将已接种细菌的琼脂平板、斜面或液体培养基置3℃孵箱孵育1824h，观察细菌生长情况。一般细菌孵育18~24h后即可出现生长迹象，但若标本中的细菌量少或生长缓慢的细菌(如分枝杆菌)，需培养37d，甚至48w后才能观察到生长迹象。本法适用于需氧菌和兼性厌氧菌。 2、二氧化碳培养法 ()烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，加盖密封。随燃烧产生的C增加蜡烛自行熄灭，此时缸内C浓度约为5％10％。置3℃孵箱孵育。 (2)化学法(重碳酸钠盐酸法)：按每升容积碳酸钠0.4g与1molL盐酸0.35ml比例，分别取两试剂置于容器内，放置于标本缸或干燥器内，密封后倾斜容器使盐酸与重碳酸钠接触产生C。1．菌种 葡萄球菌大肠埃希菌痢疾志贺菌枯草芽胞杆菌。 2．培养基 液体(普通肉汤)半固体和固体培养基(琼脂平板和斜面)血琼脂平板培养基。 3．其 接种环接种针灭菌L形玻璃棒ml刻度吸管。 【实验方法】 1．接种工具 （1）接种针和接种环 由三部分组成，即环（针）、金属柄和绝缘柄三部分。环（针）部分以丝制成，环直径为24mm，长58cm。 接种针(环)用酒精灯烧灼灭菌。接种针用于穿刺接种细菌，接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。 (2) L形玻璃棒：由直径23mm的玻棒弯成L形。灭菌方法通常将其用牛皮纸包扎后高压灭菌或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼。L形玻璃棒用于琼脂平板涂布接种细菌。 2接种环境 为避免接种过程中标本中的细菌污染环境及空气中的细菌污染培养物，细菌应在特定环境内接种。常用设备有超净工作台或无菌室等。 3接种方法 根据待检标本性质、培养目的和所用培养基的性质采用不同的接种方法。 (1)平板划线分离培养法 本法可使标本中混杂的多种细菌分散成单个细菌，在培养基表面各自生长繁殖形成单个菌落，以获得纯培养，为进一步鉴定细菌提供条件。 1)连续划线分离法 ①将接种环火焰灭菌，待冷后取标本或大肠埃希菌少许；②左手挎平板，五指固定平皿盖边缘，向外反转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和中指固定，向内反转手掌，并将平板边缘稍微提高呈现30。~45。角，置酒精灯前上方56cm；③右手持已取材的接种环，先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而不重叠曲线形式做连续划线接种，将整个平板布满曲线；④划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置3℃孵育1824h观察结果。 2)分区划线分离法用接种环取标本涂布于平板并在1区内做数次划线，再在2、3、4区依次划线，每划完一个区域是否需要对接种环烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定。每一区的划线与上区交叉接触，每区线间保持一定距离，密而不重叠，如此后一区菌量少于前一区，逐渐减少以至划线上的细菌呈单个菌分布，生长繁殖成单个菌落其操作要领同连续划线分离法 (2) 斜面接种法主要用于纯菌移种，以进一步鉴定或保存菌种。方法是以灭菌接种环挑取细菌后伸入斜面培养基，从斜面底部向上先划一条直线，然后再由底向上做曲线划线，直至斜面顶部。管口灭菌后标记，经3℃孵育1824h，斜面培养物呈均匀一致的菌苔，如表面不均匀，表示培养物不纯。(3)液体接种法用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种。用接种环从平板上挑取葡萄球菌、枯草芽胞杆菌菌苔或菌落，先在接近液面的试管壁上研磨并沾取少许液体培养基与之调和，使细菌均匀分布于培养基中。管口灭菌后加塞、标记，经3℃孵育1824h，观察并记录细菌在液体培养基的生长现象。由于菌种不同，可出现均匀混浊、沉淀生长或表面生长(形成菌膜)等不同的生长现象。 (4)半固体穿刺接种法 用于半固体培养基接种，以保存菌种或观察细菌的动力和生化反应。方法是用接种针分别挑取，于半固体培养基的中心处向下垂直穿刺接种，直至试管底部上方5mm左右(不能穿至试管底)，接种后的接种针沿原穿刺线退出。管口灭菌后加塞、标记，经37℃孵育1824h．观察结果。有鞭毛的细菌(如大肠埃希菌)能够沿穿刺线向四周扩散生长，为动力试验阳性；而无鞭毛的细菌(如福氏志贺菌)只能够沿穿刺线生长，不能扩散，为动力试验阴性。 (5)涂布接种法用于测定标本中活菌数和药敏试验的细菌接种。 菌数测定 取一定稀释度的菌液01ml滴于平板上，用无菌L型玻璃棒涂布均匀，