第2单元 免疫沉淀类实验课件.pptVIP

第二单元 免疫沉淀实验;实验一 双向免疫扩散试验; 在琼脂凝胶中，待检人血清IgG和羊抗人IgG抗血清在不同孔内各自向四周扩散，在比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明两者发生特异性结合反应。;试剂 健康人血清，用生理盐水做1:5~1:40系列倍比稀释 、羊抗 人IgG抗血清、10~15g/L琼脂糖或琼脂粉 。 仪器 水浴箱、温箱 。 材料 载玻片、微量加样器、打孔器、5ml吸管、吸球、湿盒等 。;制备琼脂凝胶：用生理盐水配置10～15g/L琼脂，隔水加热煮沸备用。 浇板：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取4~4.5ml融化的琼脂倾注于玻片上，滴加时注意速度不要过快，要使琼脂盖满整张玻片，使其均匀、饱满，勿溢出并避免产生气泡。 打孔 ：待琼脂凝固后，将梅花形打孔模板置于琼脂板下，用直径3mm的打孔器打孔，使其孔径为3mm，孔距为4mm，孔要求圆整光滑，孔缘不能破裂，底部勿与载玻片脱离。 加样：用10μl微量加样器分别取抗原、抗体加入孔中。中心孔加入抗体，周围孔分别加入不同稀释度的抗原。 温育：将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察沉淀线。; 以出现沉淀线的正常人血清最高稀释度为人血清IgG的扩散效价。;北华大学 王雪松;实验二 单向免疫扩散试验; 将一定量的羊抗人IgG抗血清成分混合于琼脂凝胶中，制成含有特异性羊抗人IgG抗血清的琼脂板，待凝固后打孔，并在相应孔中加入待检人血清IgG。使待检血清在琼脂板中向四周呈环状扩散，在两者浓度比例恰当处形成肉眼可见的白色沉淀环，沉淀环的直径或面积与待检人血清浓度呈正相关。同时用标准免疫球蛋白或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测人血清IgG浓度。;实验器材和材料;实验方法;加样:稀释人免疫球蛋白工作标准品：取冻干人免疫球蛋白工作标准品1支加蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成不同的稀释度。其稀释范围为1:5、1:10、1:20、1:40，IgG相应含量为2020、1010、505、252mg/L。稀释待检血清：将待检血清用生理盐水做1:40稀释。用微量加样器分别吸取各稀释度的人免疫球蛋白工作标准品10μl加入到标准抗原孔，制备标准曲线。再用同样的方法吸取已稀释好的待检血清10μl加入到待检血清孔。 扩散:将加好样的琼脂凝胶板平放于湿盒中，37℃温箱温育24h，观察结果。如果沉淀环不清晰，可用生理盐水浸泡2~3h。;操作示意图;结果判断;实验讨论;实验三 对流免疫电泳; 在偏碱性的缓冲液和适当的直流电场中，抗原和抗体的扩散具有一定的特点。在pH8.6以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原解离带负电荷，在电场中向正极泳动；而大部分抗体属于IgG，在此种pH条件下只带微弱的负电荷，由于其分子量大，暴露的极性基团少，在电场中泳动缓慢，且受电渗作用的影响，带正电荷的液体推动抗体分子向负极泳动。由此抗原、抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的白色沉淀线。;实验器材和材料;制备巴比妥琼脂凝胶：取出一清洁载玻片，用75%乙醇冲洗干净，晾干备用。将1%巴比妥琼脂融化后，置56℃水浴中备用。用吸管吸取4~4.5ml琼脂溶液滴加于玻片上，室温放置，待凝固后打孔，孔径3mm，孔距10mm。 加样：用微量加样器分别吸取抗原10μl加入阴极侧孔内，抗体10μl加入阳极侧孔内，所加样品切勿外溢。 电泳：将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加pH8.6的0.05mol/L巴比妥缓冲液至电泳槽的三分之二处，琼脂板两端分别用盐桥与缓冲液相连。控制端电压为5~6V/cm板长，电泳30~60min。电泳完毕后，切断电源。;操作示意图; 在抗原和抗体两孔之间形成的白色沉淀线即为抗原抗体复合物。如果沉淀线不够清晰，于湿盒中37℃保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。;北华大学 王雪松;实验四 抗原物质的变化及性质分析 （设计性实验）; 是指能够刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与相应免疫应答的产物在体内或体外发生特异性结合反应的物质。;实验原理;首先制备出未处理抗原物质的抗体，用该抗体与处理前和处理后的物质分别进行免疫反应，观察处理前后抗原性是否发生变化。 然后制备出处理后抗原物质的另一抗体，用该抗体与处理前和处理后的抗原物质分别进行免疫反应，观察抗原性是否有变化。 ;实验设计提示;有哪些理化因素能够导致抗原性发生变化，变化的特点和意义是什么？ 免疫电泳的方法是否可以用于观察抗原物质性质的变化？ 是否能设计定量观察大分子抗原物质抗原性变化的实验？ ;临床见习 免疫比浊分析