蚓激酶研究和应用进展课件.pptxVIP

蚓激酶研究和应用进展　早在1596年我国《本草纲目》对蚯蚓的药用就有详细记载。1878年法国人发现蚯蚓消化器官的分泌物能降解纤维蛋白。20世纪70年代以来,中国、日本和韩国的科学家对蚯蚓提取物进行了酶学组分、理化性质及临床应用的研究。1979年Pak发现蚯蚓提取物中含有能降解酪蛋白、明胶和清蛋白的水解酶。1983年Mihara等从粉正蚓(Lumbricus rubullus)中分离出具有溶纤活力的粗提物,并将其命名为蚓激酶(lumbrokinase)。随后,蚯蚓纤维蛋白水解酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)、丝氨酸内切蛋白酶、蚯蚓磷脂激酶等相继被分离出来。其中EFE水解纤维蛋白的活性较强,适用于防治血栓及栓塞性疾病。因此EFE的分离纯化、理化性质、作用机制及临床应用受到国内外广泛的重视。1　蚓激酶的分离纯化1·1　来源于粉正蚓(Lumbricus rubullus)的纤溶酶　通过层析、电泳、质谱等对氨基酸组成、N-末端序列等方面的研究,Nakajima等确定了来源于粉正蚓的EFE含有6个丝氨酸蛋白酶组分:F-I-0,F-I-1,F-I-2,F-Ⅱ,F-Ⅲ-1,F-Ⅲ-2,并测定它们的N端序列,见表1。嘉树等报道了来源于赤子爱胜蚓的相对分子质量为45×103的EFE由2个片断组成(26×103和18×103),其中大片段有催化活性,其N端序列与日本报道F-Ⅲ-1(或F-Ⅲ-2)和F-Ⅱ的相似。中国科学院生物物理研究所蚓激酶研究小组从事该领域研究已经有十几年的时间,最近他们将来自赤子爱胜蚓的蚓激酶组分A(EFEa)培养出了单晶,并用X-射线衍射分析其晶系,测定晶胞参数,收集完整的分辨率数据,测定氨基酸序列,构建完整的结构模型,并提出与底物结合、剪切机制。EFEa是第一个被确定三维晶体结构的蚓激酶组分,也是第一个来源于环节动物的丝氨酸蛋白酶的晶体结构。序列比较显示EFEa与F-Ⅱ基本一致。北京百奥药业公司最近也分离出蚓激酶单一组分,体外溶栓试验和毒性试验均显示良好结果,目前尚无进一步的报道。李莉[4]采用琼脂糖凝胶-间氨基苯硼酸亲和层析法从蚯蚓的匀浆中分离纯化出一糖基化组分,经SDS检测为单一成分,质谱测定其相对分子质量为24 193。N-末端的序列为:Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Asp-Ile-,与已知的纤溶酶都不同。该糖基化组分对纤维蛋白和蛋白酶底物Chromozym TH具有显著的水解活性。13来源于双胸蚓(Lumbricus bimastus)的蚓激酶　牛勃等[5]经分离纯化获得了一个相对分子质量为22·1×103的单一蛋白酶组分。梁国栋等测定了一种来源于双胸蚓蚯蚓纤溶酶的mRNA序列(Genbank,AF109648),其编码的成熟肽序列N端与F-Ⅱ一致,但与F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2的序列同源性仅35%左右。14蚓激酶的序列测定和基因组结构及重组研究日本学者Nakajima等[6]报道了来源于粉正蚓中的具纤溶活性的丝氨酸蛋白酶组分F-Ⅲ-1, F-Ⅲ-2的mRNA的序列测定结果(GenBank, AB045719,AB045720), F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2的同源性达到90%左右,但是为确切不同的2种蛋白质。梁国栋等[7,8]克隆到2个蚯蚓纤溶酶基因,其中PI239编码283个氨基酸前体,成熟肽含有239个氨基酸,与国外从粉正蚓属蚯蚓中获得的纤溶酶基因有很高的同源性,属酸性蛋白质、丝氨酸蛋白酶,与人凝血酶、t-PA和尿型纤溶酶原激活物(u-PA)有一定结构同源性。另一个基因为PI242,是新发现的基因,2001年向GenBank投送了与F-Ⅲ同源性相近的组分PI239(GenBank,AF433650),并向中国国家知识产权局申报了名为《正蚓科双胸蚓属蚓激酶基因核苷酸序列及其克隆方法》的发明专利(公开号:CN 1208770A)。赵晓瑜等于2001年11月报道了来源于赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)中的一个纤溶组分的共180个氨基酸残基的氨基酸序列(GenBank,AF432224—1)。较早的相关序列报道还有韩国Choi在1995年4月向Genbank投送了与日本的F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2相应的来源于双胸蚓的2种蚓激酶的mRNA序列(Genbank,U25648,U25643),但至今没有发表相关的文献;英国学者Sturzenbaum在1997年1月向Genbank投送了与上述序列同源性很高的一个来源于双胸蚓的蚯蚓胰凝乳蛋白酶的mRNA序列(Genbank,AJ223152),但是没有发表相关文献。根据序列比较和同源性分析结果,同种组分日本和韩国学者研究结果存在差异,可能因为不同地域的蚯蚓基因发生不同的进化所造成的。这些序列的报道给蚓激酶更为具体的鉴定提供了可能。在