植物细胞组织培养的基本技术课件.ppt

* * 凝固剂 制备固体培养基，使培养物能够处于表面，既能吸收必需的养分、水分，又可不致因缺氧而死亡。 材料必须无毒害作用，且不被培养的植物组织所吸收，不与培养液成分发生化学反应。 常用凝固剂 琼脂，淀粉，滤纸等 * * 琼脂来源于石花菜等海藻。高温下融化，温度降低凝固。不会被植物和菌类吸收利用。常用浓度：0.7-1％ 质量差的琼脂要求的凝固浓度更高。 琼脂条 琼脂粉 石花菜 果冻 琼脂条 * * 3.培养基配制 母液的配制 培养基配制 培养基灭菌 * * (1)母液的配置 母液的定义 优点： 减少操作步骤；增加称量的准确性。 * * 27.8 2780 P33 参考修改 * * MS培养基 大量元素母液 微量元素母液 铁盐母液 有机元素母液 肌醇母液 植物激素母液 * * 大量元素母液（10X） NH4NO3 ????????? 16.5g KH2PO4????????????? 1.7g KNO3? ?????????????? 19g CaCl2 ·2H2O????? 4.4g MgSO4 ·7H2O???? 3.7g 溶于1000mL水，放置4℃冰箱保存。 常用10X或20X。 * * 配制大量元素母液时残留不溶物 各种化合物必须充分溶解后才能混合，混合时注意先后顺序,要注意把钙离子和硫酸根离子和磷酸氢根离子错开 * * 微量元素母液（1000X） KI???????????????????? 0. 83g Na2MoO4·2H2O??????? 0. 25g H3BO3?? ?????????? 6.2g CuSO4·5H2O????????? 0.025g MnSO4·H2O?????? ? 16.9g? CoCl2·6H2O???????????? 0.025g ZnSO4·7H2O????? 8.6g 配成1000mL母液，存放于冰箱中。 * * 铁盐母液200X Na·EDTA ?? 7.46g? FeSO4·7H2O??? 5.56g 配成1000mL母液，存放于冰箱中。 刚配制的铁盐溶液放人冰箱后出现结晶 原因是铁离子和EDTA没有螯合彻底，室温放置过夜后再移入冰箱中保存 * * 有机元素母液（1000X） 盐酸硫胺素（VB1）? 0.1g 烟酸??? 0.5g????????? 甘氨酸???????? ?? 2g 盐酸吡哆醇（VB6）? 0.5g 配成1000mL母液，存放于冰箱中。 * * 肌醇母液10X 肌醇??? 1g? 配成1000mL母液，存放于冰箱中。 常用10X或100X * * 植物激素母液 各激素单独配置，通常浓度为1mg·mL-1 生长素类 少量NaOH溶解后，加水定容。 细胞分裂素类 少量盐酸或NaOH溶解后，加水定容。 GA3 乙醇溶解。或少量乙醇溶解后加水定容。 * * （2）培养基配制 先在烧杯中放入一些蒸馏水 分别取各种母液 称取蔗糖倒入，搅拌溶解 按设计好的方案添加各种激素 用精密试纸或酸度计调整PH 加蒸馏水用量筒定溶至1L 称取5-10g左右琼脂粉,倒入上面配好的溶液中，加热至沸腾，直到琼脂粉熔化 稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧 灭菌 灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。 * * PH值 常用PH5.8 检测:试制或PH计 高压蒸汽灭菌会造成PH值下降0.2-0.5 过高或过低PH PH值过低，琼脂培养基难以凝固。 PH值过高，无极盐沉淀。 * * * * PH试纸 PH计 * * 在三角瓶中分装灭菌的培养基 * * （3）灭菌 * * * * * * * * 灭菌方法 打开锅盖，加水至水位线。 把已装好培养基的三角瓶，连同蒸馏水及接种用具等放人锅筒内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出。 然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝。 接通电源加热，当升至0．05MPa时，打开放气阀放气，回“0‘，后关闭放气阀。 当气压上升到0.10 MPa时，保压灭菌20min，到时停止加热。当气压回“0”后打开锅盖，取出培养基，放于平台上冷凝。 灭好的培养基不要放置时间太长，最多不能超过1周。 * * 传统灭菌锅 全自动灭菌锅 * * 过滤灭菌 赤霉素、玉米素、脱落酸等是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。 防细菌滤膜的网孔的直径为0.45微米(常用0.22微米)以下，当溶液通过滤液后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直