《生物显微技术第一章显微镜》课件.pptVIP

LSCM的生物学应用 细胞的三维重建 ：各类细胞骨架形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析 细胞定量荧光测定 细胞内钙离子pH值和其它离子的动态分析 细胞胞间通讯和膜的流动性 第三节 电子显微镜 1932年德国人发明电子显微镜 分辨率：极限分辨率0.2-0.25nm，为光镜的1000倍 透射电镜 （transmission electron microscope ） 超高压电镜 扫描电镜（scanning electron microscope ） 透射电镜 成像原理 热阴极发射电子 经聚光镜聚焦成束 投射到样品 ，电子路径发生改变 收集透射电子，形成图象 透射电镜特点 必须制作超薄切片 7.5-15nm 在真空中进行观察，标本不是生活状态。 电子的穿透能力有限。 與其他分析方法比較，穿透式電子顯微鏡分析是一種破壞性分析。 超高压电镜 优点： 可观察厚的切片 提高分辨率 减少辐射损伤 缺点： 使标本发生严重变化。 扫描电镜 原理： 扫描电镜的特点 可以观察样品表面的立体结构。 试样制备相对简单。 用于扫描电镜观察的样品一般需要经过干燥处理，确保在真空中观察不变形。另外，为了防止电子在标本上聚集，需要进行镀膜处理，使样品导电。 目前扫描电镜的分辨力为6~10nm，扫描电镜的最大有效放大倍率为20000X。20-20万倍之间连续可调； 电子显微镜在生物学中的应用 目前，与电子显微镜相适应，产生了很多衍生技术，如负染技术、胶体金免疫标记技术、大分子（核酸）电镜技术、复型和冷冻蚀刻技术、电镜放射自显影技术及电镜酶细胞化学技术等。这就推进了电子显微镜对细胞超微结构和分子结构的研究。电子显微镜在细胞超微结构研究、病毒结构研究、生物大分子结构研究、超微病理学研究等生命科学、生物医学等领域有广泛的应用。 当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体。 自动化与电子化。 观察体外培养细胞首选的显微镜是： A 光镜 B 倒置相差显微镜 C 暗视野显微镜 D 实体显微镜 光镜组织切片和电镜组织切片： A均为超薄切片 B 均用化学染料染色C 均可制冷冻切片D 均为固定组织 扫描电镜是主要用于观察： A 生物膜内部结构细胞器的内部结构.B 组织和细胞的表面结构 C 细胞内的多糖 D 细胞核内的结构 激光共聚焦扫描显微镜可以观察细胞的 A 细胞内部结构 B 细胞的表面结构 C 细胞的立体结构 1982年，研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器——扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope,以下简称STM）。1986年，发明者宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖 原子力显微镜（Atomic Force Microscope, AFM） 横向力显微镜（Lateral Force Microscope, LFM） 统称为扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope, SPM）。 扫描隧道显微镜 (Scanning Tunneling Microscope, STM） 隧道效应: 当具有电位势差的两个导体之间的距离小到一定程度时，电子将存在一定的几率穿透两导体之间的势垒从一端向另一端跃迁，这种电子跃迁的现象在量子力学中被称为隧道效应，而跃迁形成的电流叫做隧道电流。隧道电流有一种特殊的性质，既对两导体之间的距离非常敏感，如果把距离减少0.1纳米，隧道电流就会增大一个数量级。 STM的工作原理 扫描隧道显微镜工作工作过程  我们可以把扫描隧道显微镜的工作过程总结为：利用探针针尖扫描样品，通过隧道电流获取信息，经计算机处理得到图象。 1、原子级高分辨率。STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm。 2、可实时地得到实空间中表面的三维图像。 3、样品不受损伤，保持完好。 4、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，对生理状态下的活细胞表面结构也能进行研究。 5、扫描速度快，获取数据的时间短，成像快，有可能展开生命过程的动力学研究。 STM的优点： 1．在STM的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差． 2. STM所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。如果在样品表面覆盖导电层，则由于导电层的粒度和均匀性等问题又限制了