叶绿体的分离和荧光观察.pptVIP

叶绿体的分离与荧光观察 NO. 1 * * 2016.3. 28 细胞生物学实验 实验目的 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 低速离心 中速离心 高速离心 超高速离心 细胞匀浆 细胞 核仁 细胞骨架 大细胞器 小细胞器 核糖体 大分子 叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。 实验用品 材料 新鲜菠菜。 试剂 0.35mol/L氯化钠溶液， 0.01%吖啶橙(acridine orange)。 器材 (1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、 粗天平、荧光显微镜。 (2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布， 无荧光载片和盖片。 实验方法 一、叶绿体的分离与观察 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2. 低速匀浆3~5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。 6. 将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 实验方法 二、菠菜叶手撕片观察 轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。 (3) 观察其间接荧光：向所制手撕片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光。 实验结果 一、叶绿体的分离和观察 二、菠菜叶手撕片观察 作业 1. 在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？ 2. 游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，其颜色和强度有无差异？为什么？ *